טיפול מופעל באור של ביופילמים חיידקיים באמצעות חומר קדם-רגיש לאור

תקציר

מקור: ז'או, ק. ואחרים. מודל Invitro לחקר השפעת טיפול פוטודינמי בתיווך חומצה 5-אמינולוולינית על ביופילם סטפילוקוקוס אוראוס . J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון מדגים פרוטוקול טיפול פוטודינמי להערכת השפעות אנטיבקטריאליות על ביופילמים חיידקיים גרם-חיוביים. ביופילמים מחולקים לארבע קבוצות: שתיים מקבלות חומר קדם-רגיש לאור, ושתיים מקבלות בופר. כולם מודגרים בחושך, ואחריהם חשיפה לאור אדום לקבוצה אחת שטופלה בקדימות וקבוצה אחת בלבד עם בופר. מיני חמצן תגובתיים נוצרים רק בקבוצה המקבלת גם קדם וגם אור, מה שמוביל למוות תאי חיידקים. הישימות מושווה בין כל הקבוצות להערכת יעילות הטיפול.

פרוטוקול

1. יצירת ביופילם

1. היווצרות ביופילם בלוחות מיקרו-96 בארות
   1. שלפו את זן סטפילוקוקוס אוראוס USA300 ושלושה זנים קליניים היוצרים ביופילם (C1-C3) המאוחסנים בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: יכולת הזנים הקליניים ליצור ביופילמים נקבעה על ידי בדיקת לוח המיקרוטיטר.
   2. החריקו את החיידק במדיום של 5 מ"ל ציר טריפטון סויה (TSB), וחידלו באינקובטור עם ניעור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה עד לשלב הנייחון.
   3. צנטריפוגה את תרבית החיידקים הלילית ב-4,000 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנאנט. החזירו את הכדורים לריכוז סופי של 2.0 ×^{10 יחידות} יצירת מושבות (CFU)/מ"ל.
      הערה: ריכוז החיידקים הוערך על ידי מדידת צפיפות אופטית ונקבע עוד על ידי ספירת הלוחות, וחשף כי 1 OD₆₀₀ של ספנישן הכיל 1.5 ×^{10 8} CFU/mL.
   4. מדלל את השעון החיידקי ל-1:200 (1.0 × 10⁷ CFU/mL) במדיום TSB המכיל 0.5% גלוקוז. החריך 200 מיקרוליטר של תליון חיידקי לכל באר של מיקרופלטת פוליסטירן עם 96 בארות שטופלה בתרבית תאים.
   5. דגרו את המיקרופלטה באופן סטטי ב-37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות בסביבה מחומצנת היטב.
      הערה: זמן הדגירה להיווצרות ביופילם בוגר עשוי להשתנות עבור זנים חיידקיים שונים; יש לקבוע זאת לפני ניסוי הטיפול הפוטודינמי (PDT).
   6. להשליך את המדיה בבארות ולשטוף את בארות המיקרופלטה בעדינות עם PBS שלוש פעמים ואז להשליך את הסופרנטנט.
      הערה: יש לבצע את השלב בעדינות רבה כדי למנוע הפרעה לביופילם שנוצר.

2. הקרנת אור

1. אחסן חומצה 5-אמינולווליניק (5-ALA) במקרר בטמפרטורה של 4°C. לפני הניסוי, יש לדלל 5-ALA עם PBS ל-10 mM.
   הערה: תמיסת 5-ALA צריכה להיות מוכנה טרייה לפני הניסוי.
2. בקבוצת הניסוי, הוסף 200 מיקרוליטר של 10 מילימטר ALA לכל באר של המיקרופלטה או 2 מ"ל לצלחת הגידול. כסה את הצלחת/הצלחת בנייר אלומיניום, ודגרה במשך שעה. לאחר מכן, הקרינו את הצלחת/הצלחת עם דיודה פולטת אור (LED) בעוצמת אור של 100 mW/^cm2 למשך שעה כדי להגיע למינון קל של 360 J/^cm2 באורך גל עיקרי של 633 ±-10 ננומטר.
   הערה: כדי לאפשר לאנרגיית האור להיות מועברת בצורה יעילה ושווה לביופילם בכל הבארות/הצלחות, קבע את המרחק משיא מקור האור לבאר/צלחת ב-6.0 ס"מ, והגבל את אזור הניסוי לאזור הקרינה המרכזי (10 ס"מ × 8 ס"מ). כדי להבטיח שהתוצאות יהיו ניתנות לשחזור, יש לבצע את הניסויים באותה טמפרטורת חדר. בשלב הקרינה של LED, כדי להימנע מחשיפה ישירה של הפלטה למקורות אור אחרים, כמו אור שמש, תאורה בחדר או אור מנורה, ה-LED הופעל לפני העברת הצלחת/הצלחת לאזור הקרינה, והאור היה חזק מספיק כדי לסיים את הפעולה.
3. הגדרת קבוצות הביקורת (שלוש קבוצות ביקורת הוקמו בניסוי שלנו).
   1. לקבוצת ביקורת ראשונה (ALA-LED-), יש להוסיף 200 מיקרו-ליטר PBS לכל באר של המיקרופלטה או 2 מ"ל לצלחת הגידול. כסו את הצלחת/הצלחת בנייר אלומיניום, ודוגרו אותה במשך שעתיים.
   2. לקבוצת ביקורת שנייה (ALA+LED-), הוסף 200 מיקרו-ליטר של 10 מ"מ מולר ALA לכל באר של המיקרופלטה או 2 מ"ל לצלחת התרבית. כסו את הצלחת/הצלחת בנייר אלומיניום, ודוגרו אותה במשך שעתיים.
   3. לקבוצת הביקורת השלישית (ALA-LED+), הוסף 200 מיקרו-ליטר PBS לכל באר של המיקרופלטה או 2 מ"ל לצלחת התרבית. כסו את הצלחת/הצלחת בנייר אלומיניום, ודגרו אותה במשך שעה. לאחר מכן, חשפו את הלוח ל-LED עם הקרנת אור של 360 J/cm² באורך גל עיקרי של 633 ± 10 ננומטר.
      הערה: בשלב קרינת ה-LED, הימנעו מחשיפה ישירה של הפלטה למקורות אור אחרים, כגון אור שמש, תאורה בחדר או אור מנורה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ציר סויה טריפטון (TSB)	אוקסואיד	CM0129B
SYTO9	תרמו פישר סיינטיפיק	L7012	ערכות החיידקים ALIVE/DEAD BacLight
פרופידיום יודיד (PI)	תרמו פישר סיינטיפיק	L7012	ערכות החיידקים ALIVE/DEAD BacLight
חומצה 5-אמינולווליניק (ALA)	ביו-פארמה פודאן ג'אנגג'יאנג	3.1
זן סטפילוקוקוס אוראוס USA300			הפניות ל-USA 300
זנים קליניים של Staphylococcus aureus (C1-C3)			כל הזנים הקליניים בודדו ממטופלים עם רינוסינוזיטיס כרונית
מיקרופלטה עם 96 בארות	קורנינג בע"מ	3599	מיקרופלטות פוליסטירן עם תחתית שטוחה שקופה עם טיפול TC, עטופות בנפרד, עם מכסה, סטריליות
מיקרוצנטריפוגה אפנדורף 5417	אפנדורף	Z365998 | סיגמה
חממה	תרמו פישר סיינטיפיק	SHKE4000	שייקרים אורביטליים עם ספסל MaxQ 4000
דיודה פולטת אור (LED)	ווהאן יאגה טכניקת אופטיקה ואלקטרוניקה CO	LED-IB