הכנת דגימה והדמיה של חיידקים מסומנים פלואורסצנטית

תקציר

מקור: צ'טריט, ד. ואחרים. יישום הדמיית תאים חיים וטומוגרפיית קריואלקטרונים לפתרון תכונות מרחב-זמן של מערכת ההפרשה Legionella pneumophila dot/ICM. J. Vis. Exp. (2020).

הווידאו הזה מדגים את ההכנה וההדמיה של חיידקים פתוגניים מסומנים בפלואורסצנטית. כריות אגרוז מוכנות וממוקמות תחילה בתוך מסגרת דבק. תלייה של חיידקים מהונדסים גנטית המבטאים חלבון פלואורסצנטי מוחל על הפד כדי לייצב את התאים. המסגרת נאטמת באמצעות כיסוי ונצפית תחת מיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות פלואורסצנציה של חיידקים.

פרוטוקול

הערה: כל ההליכים הכוללים גדילה, מניפולציה והדמיה של L. pneumophila צריכים להתבצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 בהתאם להנחיות המקומיות.

1. הכנסת sfGFP לכרומוזום Legionella pneumophila באמצעות אסטרטגיית החלפה אללית ובחירה כפולה (איור 1, איור 2)

1. שכפול לתוך וקטור החלפת הגנים pSR47S11 את הרצף הבא: 1,000 bp במעלה הזרם של אתר העניין, אחר כך רצף sfGFP, ואז 1,000 bp במורד הזרם של אתר העניין (איור 1). רצף ה-sfGFP צריך להיות ממוקם במסגרת לקצוות N-טרמינוס או C-טרמינוס עם מקשר המכיל ארבע עד שמונה חומצות אמינו. המרו את הווקטור המתקבל ל-Escherichia coli DH5αλpir. לאחר מכן, יש להטיל פסים של L. pneumophila (המקבל) עבור מושבות בודדות על אגר תמצית פחם-שמרים (CYE) המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין וגדל במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (איור 2).
2. Streak L. pneumophila על CYE-אגר-סטרפטומיצין וגדל במשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס (כתם כבד). סטריק E. coli DH5α עבר טרנספורמציה עם פלסמיד עזר pRK600 (עוזר) על אגר LB המכיל 25 מיקרוגרם/מ"ל כלורמפניקול. פס את ה-E. coli DH5αλpir (התורם) על אגר LB המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קאנמיצין.
3. ביצוע הזדווגות תלת-הורית: דגרו מושבה של העוזר, מושבה של התורם והמקבל על ידי הצבת כתמים של שלושת הזנים על צלחת אגר CYE ללא ברירה ודגירה למשך 4–8 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. כביקורת שלילית, יש לדגור תערובת זן עוזר/מקבל ותערובת זן תורם+מקבל לאותן תקופות זמן.
4. החזירו את תגובות ההזדווגות ב-500 מיקרוליטר של ddH₂O. לוחות 20 מיקרוליטר ו-50 מיקרוליטר של התגובות על אגר CYE המכילים 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל קאנאמיצין וגדלו במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ארבעה מהשיבוטים המתקבלים על אגר CYE המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין וגדלו במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. סטריק 16 שיבוטים על אגר CYE המכיל 5% סוכרוז ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין וגדלים במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, 32 מהשיבוטים הללו על אגר CYE המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ועל אגר CYE המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל קאנאמיצין, וגדלים במשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

2. בידוד שיבוטים ששילבו sfGFP בכרומוזום L. pneumophila

1. שיבוטים של פסים שהיו רגישים לקאנמיצין על לוחות CYE-אגר-סטרפטומיצין מאשרים את הכנסת sfGFP לכרומוזום באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מושבה (PCR). השתמשו בפריימרים שמשלימים את גן sfGFP ואת אזור הכרומוזום המעניין כדי להגביר את צומת ההכנסה.
   1. מערבבים 0.5 מיקרוליטר מכל אחד מתמיסות הפריימר של 10 מיקרומולטר ומושבה אחת לנפח סופי של 12.5 מיקרוליטר ודדנטור למשך 10 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס. קרר על קרח למשך 10 דקות, מוסיפים 12.5 מיקרוליטר של 2x PCR מאסטר מיקס, ומבצעים ניתוח PCR.
2. גדלו כתמים כבדים של המושבות המבודדות על פלטות CYE-agar-סטרפטומיצין למשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בדקו את רמות הביטוי והיציבות של איחוי sfGFP על ידי אימונובלוטה בנוגדן אנטי-GFP.

3. הדמיית תאים חיים של L. pneumophila עם רכיבי נקודות/ICM מסומנים פלואורסצנטית

1. הכנת רפידות אגרוזות
   1. הכינו כ-30 מ"ל של תמיסת אגרוז עם 1% נמס נמוך במים. חממו במיקרוגל בבקבוק זכוכית במשך כ-90 שניות, תוך סחרור מדי פעם, עד שהאגרוז נמס לחלוטין.
   2. הניחו שתי שקופיות זכוכית בגודל 22 x 22 x 0.15 מ"מ^על שפת זכוכית בגודל 25 x 75 x 1.1 מ"מ³ זכוכית, אחת מעל השנייה. ערמו עוד שני מחסניות זכוכית בגודל 22 x 22 x 0.15 מ"מ^בקצה השני.
   3. פיפט כ-1 מ"ל של האגרוז המותך לתוך המחסנית המרכזית בין שתי הזכוכית העליונות, ואז מניחים סלייד נוסף בגודל 25 x 75 x 1.1 מ"^{מ 3} מעל האגרוז המותך. נסה להימנע מהיווצרות בועות אוויר. קרר את המגלשות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
   4. באמצעות סכין גילוח או להב גילוח, חתכו בעדינות את המשטח לריבועים קטנים, ~5 x 5 מ"מ². תקבע מסגרת דבק דו-צדדית בגודל 17 x 28 x 0.25 מ"^{מ 3} על סלייד^{זכוכית בגודל} 25 x 75 x 1.1 מ"מ 3 ומניח כמה רפידות על הסלייד.
2. רכישת תמונה
   הערה: השלבים הבאים מתוארים עבור מיקרוסקופ שנמצא תחת שליטת SlideBook 6.0 ומצויד במאירי מצב מוצק, מצלמת CCD מונוכרומטית ועדשה אובייקטיבית 100x (צמצם מספרי 1.4). במידת הצורך, יש להשתמש במכשירי מיקרוסקופיה חלופיים עם תצורות חומרה ותוכנה מתאימות שניתן להתאים אישית בהתאם להגדרות הפרוטוקול.
   1. המיס כתם כבד של L. pneumophila ב-1 מ"ל ddH₂O, מערבולת ופיפט 2–3 מיקרולטר של הדילול על הרפודים. הנח בעדינות כיסוי 50 x 24 x 0.15 מ"^{מ 3} מ"מ מעל מסגרת הדבק.
   2. בחלון הלכידה כוון את ה-ND ל-180. כוון את הבינינג ל-2×2 והשתמש בערוץ 488 ננומטר כדי לחשוף את הדגימה בין 500–1,000 מילישניות. אימות הספציפיות של אות הפלואורסצנציה על ידי הדמיה של L. pneumophila לא מתויג עם אותם פרמטרים (איור 3).

תוצאות

איור 1: סקירה סכמטית של רקומבינציה הומולוגית והחלפה אללית המשמשת להחדרת sfGFP לכרומוזום L. pneumophila.(א) בוצעה הזדווגות תלת-הורית בין זן עזר של E. coli MT616 שמכיל את הפלסמיד הקוניגטיבי pRK600 (פלס...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יעד 100x Plan Apo (1.4 NA)	ניקון
אסים	סיגמא-אלדריץ'	A9758
פחם פעיל	סיגמא-אלדריץ'	C5510
Agarose GPG/LMP, נמס נמוך	ביואנליטיקה אמריקאית	AB00981
אגר מיובש בבקטו	BD	214010
מסגרת ג'ין, 1.7x2.8 ס"מ, 125 מיקרוליטר	פישר סיינטיפיק	AB-0578
L-ציסטאין	סיגמא-אלדריץ'	C7352
שקופיות כיסוי מיקרוסקופ בגודל 22x22 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-542B
סליידי כיסוי מיקרוסקופ בגודל 24x50 מ"מ	פישר סיינטיפיק	12-545K
שקופיות מיקרוסקופ בגודל 25x75x1 מ"מ	גלוב סיינטיפיק	1380
Slidebook 6.0	חידושים בהדמיה חכמה
מנוע קל ספקטרה X	לומנקור
Taq 2X Master Mix	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	M0270
טיטאן קריוס	תרמו פישר סיינטיפיק
תמצית שמרים	BD	212750