הקמת מודל עכבר של זיהום בקלוסטרידיום דיפיקילה

תקציר

מקור: וינסטון, ג'. א. ואחרים. מודל עכבר מטופל בספפרזון של זן Clostridium difficile R20291 הרלוונטי קלינית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את ההליך לחיסון עכברים שטופלו מראש באנטיביוטיקה בנבגי Clostridium difficile כדי לקבוע מודל זיהום עכברי לחקר פתוגנזה ותגובות המארח.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת חיסון הנבגים של Clostridium difficile וה-Gavage האוראלי של העכברים

הערה: עכברים עם בעיות נבגי C. difficile צריכים להיות מאוחסנים במתקן בעלי חיים ברמת בטיחות ביולוגית 2.

1. השגת מלאי נבגים של C. difficile מהזן הרצוי (במקרה זה, R20291) שהוכן ואוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במים סטריליים. קבע את מניין הנבג הזה לפני השימוש.
2. בהתבסס על הריכוז הידוע (נבגים/מ"ל) של מלאי הנבגים, חשב את הדילול הרצוי כדי לקבל 10⁵ נבגים ל-25 מיקרוליטר. ודא שנפח האינוקולום מספיק כדי להחסין את כל העכברים בניסוי (25 מיקרוליטר לעכבר), לבצע את מניין החיסון (כ-30 מיקרוליטר), ולהתחשבות בטעות בפיפטר.
3. Vortex הוא המאגר המקורי של C. difficile . לאחר מכן, החזירו את הנפח המחושב (מהשלב 1.2) של מאגר הנבג המקורי של C. difficile במים סטריליים בתוך צינור מיקרוצנטריפוגה עם מכסה ברגים. בצע זאת אירובי על מכסה זרימה למינרי. זהה את התערובת המדוללת הזו כ"חיסון הנבגים".
4. הכניסו את החיסון לנבג באמבט מים בטמפרטורה של 65°C וחממו אותו במשך 20 דקות.
   הערה: שלב זה יבטיח שרק נבגי C. difficile פעילים יישארו לאחר הטיפול בחום.
5. בתוך מכסה הזרימה הלמינרי, יש לקחת 50 מיקרוליטר של אינקולום נבגים מחומם, להניח אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי, ולהעביר אותו לתא האנאירובי. השתמש בדגימה זו לספירת הנבגים.
6. בתוך מכסה זרימת הלמינרי, טען את חיסון הנבגים המחומם שנותר למזרק של 1 מ"ל המחובר למחט קיבה סטרילית עם קצה בורה סטרילית. השתמשו במזרק ידני כדי להבטיח מינון מדויק ומהיר וחוזר בין העכברים. ודאו שמחט הגוואג' מלאה בחינון הנבג המחומם לפני השימוש.
   הערה: לא נדרש מחט סטרילית חדשה לכל עכבר. עם זאת, אם ניתנים מינונים שונים של נבגי C. difficile , מומלץ להשתמש במחט גאבאז' חדשה לכל מנה.
   הערה: נבגי C. difficile עמידים מאוד לחומרי חיטוי מסורתיים. לכן, יש צורך בשימוש בחומר חיטוי ספורוסידי, כגון #62 Perisept Sporicidal Disrapeant. היצרן ממליץ על זמן מגע של 2 דקות כדי להשמיד את נבגי C. difficile .
7. גאווג לכל עכבר עם 25 מיקרול של חיסון הנבגים. הרסן כל עכבר בעדינות על ידי אחיזת החיה בעור הרפוי של הצוואר והגב כדי לשתק את הראש. שימוש באצבע המורה משתק עוד יותר את ראש החיה ומאריך את הוושט. ודאו שהחיה אינה משמיע קולות או מראה סימני מצוקה אחרים בזמן הריסון.
   הערה: הנפח הכולל שניתן לעכברים על ידי הגוואז' לא צריך לעלות על 10 מ"ל/ק"ג משקל גוף (0.1 מ"ל/10 גרם).
8. שמרו על העכבר במצב זקוף ואנכי והעבירו בעדינות את מחט הגאווייג' לצד הפה. כוון את מחט הגאבג' לאורך גג הפה וקדם לאט את מחט הגוואג' אל הוושט.
   הערה: אם נתקלת התנגדות כלשהי, מחט הגוואג' עלולה להיכנס לקנה הנשימה ולכן לא צריכה להתקדם, אלא להסיר אותה ולמקם אותה מחדש מיד.
9. לאחר שמחט הגוואג' נמצאת בערך באמצע הוושט, מזריקים 25 מיקרוליטר מהחיסון המחומם של הנבג ומשכו בעדינות את מחט הגוואג' מהוושט.
   הערה: התקדמות חזקה של מחט הגוואג' עלולה להוביל לקרע בוושט או בקיבה. לכן, אם יש התנגדות בעת התקדמות מחט הגוואג', עדיף להסיר מיד ולמקם מחדש את מחט הגאבג'.
10. החזירו את החיה לכלוב וצפו בה לאיתור שיעול או סימני קושי נשימה, שכן הדבר עשוי להעיד על מתן לא מכוון של קנה הנשימה או שאיבת חיסון הנבג המחומם.
    הערה: עכברים רגישים מאוד ל-C. difficile לאחר טיפול אנטיביוטי; לכן, אמצעי זהירות למניעת זיהום צולב בין כלובים הם חיוניים. זה חשוב במיוחד כאשר מטפלים בעכברים שטופלו באנטיביוטיקה אך לא עוברים אתגר כאמצעי ביקורת.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
#62 חומר ניקוי חיטוי ספודיציאלי פריספט	SSS נווט	48027	מוצר זה ידרוש דילול כפי שהומלץ על ידי היצרן
עכברי C57BL/6J	מעבדת ג'קסון	664	עכברים צריכים להיות בגיל 5-8 שבועות
פקק בורג מיקרו צנטריפוגה 2 מ"ל	קורנינג	430917