כימות של Clostridium difficile בדגימות צואה ממודל עכבר נגוע

תקציר

מקור: וינסטון, ג'יי. א. ואחרים. מודל עכבר מטופל בספפרזון של זן Clostridium difficile R20291 הרלוונטי קלינית. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים את הכימות של Clostridium difficile בדגימות צואה ממודל עכבר נגוע באמצעות טכניקות תרבית סלקטיביות. הוא מפרט את ההליכים לאיסוף דגימות, עיבוד אנאירובי, דילול סדרתי וספירת מושבות להערכת התיישבות חיידקית ואינטראקציות בין מאכסן-פתוגנים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים המוסדית המקומית וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. השגת דגימות למניין Clostridium difficile (C. difficile)
   הערה: לפני קבלת צואה או תכולת סקול, יש לשקול צינורות מיקרוצנטריפוגות סטריליים במשקל אנליטי. רשמו את משקל הצינור בצד הצינור, תוך עיגול לארבע נקודות עשרוניות (למשל, 0.9864 גרם). סמנו משקל זה כ"משקל הצינור". כל דגימה שנאספה צריכה להיות מונחת בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ומשוקלל.
   1. אוסף סטרילי של צואת עכברים
   1. הרסן בעדינות כל עכבר על ידי אחיזת החיה בעור הרפוי של הצוואר והגב כדי לשתק את הראש. השתמש באצבע הקטנה כדי לשלוט בעדינות בזנב החיה, וכך לחשוף את פי הטבעת. ודאו שהחיה אינה משמיע קולות או מראה סימני מצוקה אחרים בזמן הריסון.
   2. החזק צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי וכבד ישירות מתחת לפי הטבעת של בעל הטבעת. חשוב מאוד שהצינור לא יבוא במגע ישיר עם העכבר.
      1. כאשר החיה מתפרקת, אסוף את כדור הצואה לתוך הצינור. השאירו את הצינור בטמפרטורת החדר עד שכל דגימות הצואה ייאספו. לעכבר יכול לקחת כמה דקות להצרכים, ולכן יש צורך בניסיונות חוזרים לאסוף צואה.
   3. שקלו את הצינורות שמכילים צואה במשקל האנליטי. רשמו את משקל הצינור, תוך עיגול לארבעה ספרות עשרוניות (למשל, 1.0021 גרם). סמן את המשקל שהתקבל כ"משקל הצינור הסופי".
   4. העבירו את דגימות הצואה לתא האנאירובי לספירת חיידקים מיד לאחר איסוף הצואה.
2. מניין חיידקים של C. difficile
   1. חשב את המשקל הסופי של התכולה (הצואה) שיסופר עבור C. difficile. ביצעתי זאת על ידי הפחתת "משקל הצינור הסופי" מ"משקל הצינור".
   2. חשב דילול של 1:10 של התכולה ל-1X מלח עם מאגר פוספט (PBS) והשעה מחדש בהתאם. לכדורי צואה, השתמשו בקצה הפיפטה כדי לשבש בעדינות את הכדור לתמיסה.
   3. דגירה אנאירובית של הדגימות שהוחזרו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, מה שמאפשר לתכולה לשקוע.
   4. בצע דילול סדרתי לכל דגימה ב-1x PBS למניית יחידות יוצרות מושבה (CFU) לכל גרם תכולה (צואה). בצע את זה אנאירובית.
   5. באמצעות טכניקת אספטיה, העבר 100 מיקרוליטר מכל דילול סדרתי לצלחות טאאורוכולאט ציקלוסרין ספוקסיטין פרוקטוז אגר (TCCFA). באמצעות מפזר סטרילי בצורת L, פזרו את הדילול שהוחל על המדיה כדי לפזר אותו באופן שווה על פני הצלחת. אפילו הפצת הדילול חיונית לספירה מדויקת של מושבות.
   6. דגרו את הלוחות בצורה אנאירובית במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, יש למנות מושבות C. difficile כדי לקבל את ה-CFU לכל גרם של תכולה (צואה). מושבות C. difficile שטוחות וצהובות בהירות, עם קצוות לא סדירים ומראה זכוכית טחונה.
      הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש למניית C. difficile מתוכן אחר במערכת העיכול (GI) של עכברים, כולל תכולת איליאל וקולוני. לוחות תגובת שרשרת פולימראז (PCR) יכולים לשמש לייצור דילול סדרתי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1x PBS	גיבקו	10010-023
בקטו אגר	בקטון דיקינסון	214010	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
פפטון פרוטאוז בקטו	בקטון דיקינסון	211684	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
ספוקסיטין	סיגמא	C47856	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
פקק בורג מיקרו צנטריפוגה 2 מ"ל	קורנינג	430917
D-ציקלוסרין	סיגמא	C6880	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
פרוקטוז	פישר	L95500	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
אשלגן דיהידרוגן פוספט	פישר	P285-500	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
מגנזיום סולפט (ללא מים)	סיגמא	M2643	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
מסנן Millex-GS 0.22 מיקרון	מילקס-GS	SLGS033SS	מסנן ללוחות TCCFA
די-נתרן מימן פוספט	סיגמא	S-0876	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
NaCl	פישר	S640-3	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
לוחות PCR	פישרברנד	14230244
צלחת פטרי מפלסטיק	מותג קורד-ולמרק	2900
מפזר תאים פלסטי סטרילי בצורת L	פישרברנד	14-665-230
טאורוכולאט	סיגמא	T4009	חלק מלוחות TCCFA (ראו להלן)
מים מזוקקים אולטרה-טהורים	Invitrogen	10977-015
עכברי C57BL/6J	מעבדת ג'קסון	664	עכברים צריכים להיות בגיל 5-8 שבועות