בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לחקר אינטראקציות בין קולטני מאקרופאגים לאנטיגנים חיידקיים

תקציר

מקור: ברברו, א. מ., et.al. בדיקות פלואורסצנציה למחקר האינטראקציה בין מיקובקטריום טוברקולוזיס לבין קולטני החיסון SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)

הסרטון הזה מדגים בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לחקר האינטראקציה בין קולטן מקרופאגים לאנטיגנים של מיקובקטריום טוברקולוזיס . אנטיגנים מסומנים פלואורסצנטית על כיסוי נעים עם תמציות חלבון מקרופאג', מקושרים בהצטלבות, מסומנים בנוגדנים, ומוצגים באמצעות אותות פלואורסצנציה חופפים.

פרוטוקול

1. אינטראקציה בין מיקובקטריום טוברקולוזיס ל-SLAMF1 באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה

1. קישור צולב בין חיידקים לחלבון
   1. הכנס כיסוי עגול בקוטר 12 מ"מ ללוחות תרבית 24 בארות (1 כיסוי לכל באר) באמצעות פינצטה כירורגית עגולה.
      הערה: נקה היטב את הכיסוי עם 70% אתנול. אם רוצים, ניתן לאוטוקלף או לחטא אותם תחת אור UV למשך 30 דקות.
   2. דגרו את הכיסוי ב-400 מיקרוליטר של פולי-די-ליזין 10 מיקרוגרם/מ"ל בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כסו את הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מאור.
   3. למחרת, הוציאו את הצלחת מהמקרר ושטפו את הכיסוי פעמיים עם 1 מ"ל מים.
   4. תן לכיסוי להתייבש.
   5. מדלל 20 מיקרוליטר (2 x 10⁶) של Mtb-R Ags ב-180 מיקרוליטר של 1x PBS. ה-200 מיקרולטר האחרונים מספיקים לכסות לחלוטין כיסוי.
   6. דגרו את ה-coverslip עם Mtb-R Ags למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תאים.
   7. זרקו את הנוזל הנותר ושטפו פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS (סליין עם בופר פוספט).
      הערה: בשלב זה, ניתן לבדוק את ההיצמדות הנכונה של Mtb-R לכיסוי הכיסוי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה באמצעות המסננים המתאימים לתעלה האדומה.
   8. הוסף 400 מיקרוליטר של בופר חוסם (10% סרום בקר עוברי (FBS)) ב-1x מלח עם בופר פוספט (PBS) למשך 30 דקות ב-RT בערבוב (שייקר).
   9. שטוף פעמיים עם 400 מיקרוליטר של בופר חסימה.
   10. דגרו עם 100 מיקרוליטר של תמצית חלבון מדוללת ב-300 מיקרוליטר של 1x PBS למשך שעתיים ב-RT בערבוב (שייקר).
   11. הוסף 400 מיקרוליטר של 1% פורמלדהיד מדולל ב-1x PBS. דגרו במשך 15 דקות תחת ערבוב (שייקר) ב-RT.
   12. הוסף 500 מיקרול גליצין 0.125 מטר מדולל במים. דגרו במשך 5 דקות תחת ערבוב (שייקר) ב-RT.
   13. שטוף פעמיים עם 1 מ"ל של 1x PBS.
   14. הוסף 400 מיקרוליטר של 2 מילימטר אתילן גליקול ביס(סוקינימידיל סוקסינט) (EGS למשך שעה אחת ב-RT בערבוב (שייקר).
   15. חזור על שלב 1.1.13
       הערה: מומלץ מאוד להכין את התגובות בזמן השימוש.
2. צביעת SLAMF1
   1. עטוף את מכסה צלחת התרבות בסרט פרפין.
   2. הוסיפו טיפה של 60 מיקרוליטר של נוגדן ראשוני נגד SLAMF1 (דילול 1:75) על המכסה המכוסה בסרט פרפין.
   3. הסר בזהירות את הכיסוי מהפלטה באמצעות פינצטה ומחטים כירורגיות מעוקלות עם קצה דק.
      הערה: כדי להקל על הסרת הכיסוי, ניתן לכופף את המחט בזווית של כ-45°.
   4. הפוך את הכיסוי מעל הטיפה שמכילה את הנוגדן. תדגר 30 דקות ב-RT בחושך.
   5. הרם את הכיסוי ושוטף פעמיים עם בופר החסימה.
   6. הפוך את הכיסוי מעל טיפה חדשה המכילה את הנוגדן המשני (דילול 1:200). תדגר 30 דקות ב-RT בחושך.
   7. חזור על שלב 1.2.5.
   8. הסר את הנוזל העודף והתקן את ה-coverslip על טיפה של נוזל הרכבה המונח על מחסנית זכוכית.
   9. התבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה באמצעות מסננים מתאימים.
      הערה: מומלץ לעבוד בתנאים סטריליים. לדלל את הנוגדנים בבופר החסימה. טפל בזהירות בכיסוי הכיסוי כדי להימנע משריטות שעלולות להקשות על התצפית תחת מיקרוסקופ. נוזל הרכבה המתאים לפלואורסצנציה מומלץ מאוד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן משני אלקסה פלואר 488	Invitrogen	A21121	למיקרוסקופיה פלואורסצנצית
נוגדן ראשוני נגד SLAMF1	ביולג'נד	306302	למיקרוסקופיה פלואורסצנצית
אקווה-פולי/מאונט	מדעים פולי-מדעיים	18606-20	מדיית הרכבה
כיסויי 12 מ"מ	HDA	-	לבדיקת אינטראקציה במיקרוסקופיה
EGS	תרמופישר סיינטיפיק	21565	לטיפול בקישור צולב
פורמלדהיד	מרק	K47740803613	לטיפול בקישור צולב
שקופיות זכוכית	גלאס קלאס	-	לבדיקת אינטראקציה במיקרוסקופיה
גליצין	סיגמא	G8898	לטיפול בקישור צולב
Imager.A2	קרל צייס	430005-9901-000	מיקרוסקופ פלואורסצנציה עם מודול תאורה Colibri 7
פולי-די-ליזין	סיגמא אולדריץ'	A-003-M	לטיפול ב-coverslips
רודמין B	סיגמא אולדריץ'	21955	ל-M. צביעת שחפת