פיתוח מודל זיהום זחל בדג זברה באמצעות מיקרוגאבאז'

תקציר

מקור: לי, ג'. ואחרים. פיתוח מודל זיהום דג זברה זחל עבור Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).

הסרטון הזה מדגים את הליך המיקרוגבאז', שבו זחל דג זברה מורדם משותק באגרוז ומוזרק דרך הפה לחיידק פתוגני באמצעות מחט מונחית על ידי טרייסר. המשלוח הלא פולשני מדמה זיהום טבעי, ומאפשר ניתוח של שכפול חיידקים, שחרור רעלים ונזק אפיתל במעי.

פרוטוקול

1. גבאג' של זחלי דגי זברה

1. כייל את מחט המיקרוגאוויג'.
2. מדוד את קוטר קצה המחט על ידי הנחת המחט על סלייד כיול עם טיפה אחת של שמן מינרלי. ודאו שהקצה בקוטר 30–40 מיקרון, קהה וחלק. השליכו את המחטים החדות או המחוספסות.
   הערה: קצוות חדים של מחטים יכולים להיחלש על ידי להבה מהירה.
3. הכינו את תמיסת הגוואג'.
4. טען והתקן את המחט על מיקרומניפולטור.
5. כוון את המיקרומניפולטור כך שימקם את המחט בזווית של 45°.
6. הרדימו את זחלי דגי הזברה. כאשר הזחלים מפסיקים לזוז, העבירו אותם לחריץ של תבנית מיקרוגאבאז' באמצעות פיפטת פסטר.
7. הנח טיפה של 0.8% אגרוז נמס נמוך על זחלי דג הזברה לכיסוי. כוונו בעדינות את הזחלים כאשר ראשי הזחלים פונים זקופים בזווית של 45° בחריץ וזנבות כנגד דופן החריץ. ודא שזוויות הראשים דומות בערך כדי שיישארו עם זווית מחטי הגאבג'. מניחים את התבנית המיקרוגאבאז' על קרח למשך 30–60 שניות, כדי לאפשר לאגרוז עם התכה נמוכה להתגבש כדי לייצב את מיקומי הזחלים.
8. כוון את לחץ ההזרקה בין 200–300 hPa. הגדר את זמן ההזרקה ל-0.1–0.3 שניות כדי לקבל נפח הזרקה של 3–5 ננוליטר של Clostridioides difficile.
9. הפעל בעדינות את המחט דרך האגרוזה, ואז לתוך פי זחלי דגי הזברה, דרך הוושט. כאשר קצה המחט נכנס לתוך הפקעת המעי הקדמית, לחץ על דוושת ההזרקה כדי לשחרר את החיידקים. מלא את הלומן של המעי בנפח שנמסר לך. אל תתנו לו לעלות על המים מהוושט או הקלואקה. משכו בעדינות את המחט מפיו של דג הזברה.
10. לאחר הגוואג', יש להציל את זחלי דג הזברה הנגועים מהאגרוז באמצעות קצה מיקרולודר גמיש, תחילה על ידי חיתוך האגרוז ואז הרמת הזחלים. העבר את הזחלים למדיום סטרילי של 30% מדיום דנייאו. שטוף את הזחלים במדיום סטרילי פעמיים. העבר את הזחלים לצלחת פטרי טרייה בגודל 10 ס"מ. הזחלים יישארו עד 11 ימים לאחר ההפריה (DPF).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגרוז	סיגמא-אלדריץ'	A2576	אגרוז ג'לינג אולטרה-נמוך
התכה נמוכה של אגרוז (LM)	פרונדיסה	8050	הוא משמש בלוחות אגרוזות
זכוכית קפילרית	מנגנון הרווארד	30-0019	מחטי הזרקה
Clostridioides difficile			R20291,, זן ריבוטיפ 027, ייצור TcdA+/TcdB+/CDT+
DMSO	קרל רות' GmbH	A994
פיג'י	פלטפורמת קוד פתוח		עיבוד תמונה
HEPES	קרל רות' GmbH	6763
מושך מחט אופקי	סאטר אינסטרומנט בע"מ	P-87
L-ציסטאין	סיגמא-אלדריץ'	168149
לייקה Application Suite X (LAS X)	לייקה		עיבוד תמונה
מזרק מיקרו	אפנדורף	5253000017
תבניות מיקרו-הזרקה	כלי מדע אדפטיבי	TU1
מיקרוסקופ קונפוקלי Leica SP8	לייקה
פנול אדום	סיגמא-אלדריץ'	P0290
כלוריד אשלגן (KCl)	קרל רות' GmbH	5346
נתרן כלוריד (NaCl)	קרל רות' GmbH	9265
טאורוכולאט	קרל רות' GmbH	8149
טריקאין	סיגמא-אלדריץ'	E10521
תמצית שמרים	BD Bacto	212750