חיסון פתוגן חיידקי לעלים של ארבידופסיס באמצעות חדירת ואקום

במאמר זה

תקציר

מקור: רופיאן, י. ס., et.al. ניתוח תא יחיד של ביטוי גני Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון הזה מדגים שיטת חדירה בוואקום להכנסת פתוגן חיידקי לעלי הצמח של ארבידופסיס . הגישה עושה שימוש במתלה חיידקי מוכן ובפולסים של ואקום כדי לאפשר כניסה אחידה דרך סטומטה, מה שמוביל לזיהום עלים מבוקר.

פרוטוקול

1. חיסון צמחי Arabidopsis

הערה: במחקר זה, הזנים Pseudomonas syringae pv. עגבנייה DC3000 ו-P. syringae PV. נעשה שימוש בפאזאוליקולה 1448A.

הכינו את חיסון P. syringae.
1. להוציא את זן P. syringae המעניין ממאגר גליצרול של −80°C על צלחת LB (10 גרם לליטר טריפטון, 5 גרם NaCl, 5 גרם לליטר תמצית שמרים, ו-16 גרם אגר בקטריולוגי) בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה. דגרו בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 40-48 שעות.
  הערה: מומלץ להשתמש באנטיביוטיקה אם הזן הרלוונטי נושא פלסמיד או גן עמידות לגנום. ריכוזי האנטיביוטיקה המומלצים ל-P. syringae הם כדלקמן: קאנמיצין (15 מיקרוגרם/מ"ל), גנטמיצין (10 מיקרוגרם/מ"ל), אמפיצילין (300 מיקרוגרם/מ"ל).
2. מגרדים את הביומסה החיידקלית ומרחים מחדש ב-5 מ"ל של 10 מ"מ MgCl₂. מדדו את_{ה-OD 600} והתאימו ל-0.1 על ידי הוספת 10 mM MgCl₂.
  הערה: OD₆₀₀ של 0.1 של תרבית P. syringae מתאים ל-5 x 10⁷CFU·^mL−1.
3. לבצע דילול סדרתי ל-10 mM MgCl₂ כדי להגיע לריכוז האינקולום הסופי של 5 x 10⁵ CFU·^mL−1. הכינו 200 מ"ל של אינקולום לצמחי ארבידופסיס .
4. ממש לפני החיסון, הוסף את הסורפקטנט סילווט L-77 לריכוז סופי של 0.01% עבור ארבידופסיס. שימו לב שסילווט מזיק במידה מסוימת לרקמת הערבידופסיס .
בצע חדירת ואקום.
1. לחדירת ארבידופסיס, מניחים שני מקלות עץ היוצרים X מעל הסיר (איור 1E), והניחו את הסיר פונה כלפי מטה מעל צלחת פטרי בקוטר 14 ס"מ המכילה את החיסון בנפח 200 מ"ל (איור 1F).
2. הכנס את הצמחים הטבועים בתמיסת האינוקולום לתא ואקום (איור 1G) ונותן פולס של 500 מ"בר למשך 30 שניות כדי לחדור לעלים. חזור על פולס הוואקום 2-3 פעמים עד שהעלה נחדר לחלוטין (איור 1H).
3. רוקן את תמיסת החיסון העודפת עם פיסת נייר והחזר את הצמחים לתא הצמיחה המתאים להם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1: חיסון חיידקים והפקת אפופלסט באמצעות צמחי ארבידופסיס . (א) הכנת הסיר כאשר רשת המתכת מחוברת כראוי. (ב) זריעת זרעים באמצעות קיסם כדי להפציר אותם כפי שמצוין בסעיף (ג). (...