הדמיה בקצב גבוה של זיהום תוך-תאי ברוסלה אבורדוס בתאי אפיתל של המארח

תקציר

מקור: קזנובה, א., ואחרים. בדיקות מבוססות מיקרוסקופיה לסינון מהיר של גורמי מארח המעורבים בזיהום ברוסלה בתאי הלה. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים הדמיה בתפוקה גבוהה של זיהום Brucella abortus בתאי אפיתל עם הפלת STING מתווכת siRNA, כדי לחקור את תפקיד חישת DNA ציטוזולי בשכפול חיידקים תוך-תאיים ובתגובה החיסונית המולדת של המארח.

פרוטוקול

1. זיהום וקיבוע

1. יום אחד לפני ההדבקה, יש לחסן את הכמות שנקבעה של תרבית ההתחלה של B. abortus במדיום של 50 מ"ל TSB/Km (מרק סויה טריפטי המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל קאנמיצין) בבקבוק עם פקק בורג בנפח 250 מ"ל. אטום את הבקבוק בפראפילם וגדל חיידקים בלילה בטמפרטורה של 37°C ו-100 סל"ד על שייקר אורביטלי עד OD₆₀₀ = 0.8-1.1.
2. מדדו_{OD 600} של תרבית החיידקים והכינו את מדיום הזיהום על ידי דילול תרבית החיידקים ב-DMEM (Modified Eagle Medium של Dulbecco) /10% FCS (סרום עגל עוברי) כדי להשיג את ריבוי ההדבקה הרצוי (MOI).
   הערה: כדי להשיג שיעור הדבקה של 5-10% בתאי HeLa, משתמשים ב-MOI של 10,000. יש לבצע עקומת טיטרציה של MOI לכל סוג תא כדי לקבל שיעורי הדבקה מיטביים.
3. החלף את מדיום הטרנספקציה של לוח 384 בארות עם 50 מיקרו-ליטר של מדיום הזיהום באמצעות מכונת שטיפת לוחות אוטומטית.
4. צנטריפוגה את לוח ה-384 בארות בטמפרטורה של 400 x g ו-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   הערה: זה עוזר לסנכרן את תהליך ההדבקה.
5. אטום את הפלטה עם Parafilm ודוגר אותו על פלטת אלומיניום מחוממת מראש בתנור לח של 37°C עם 5%_CO2 למשך 4 שעות.
6. שטוף את התאים עם DMEM/10% FCS המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל גרם (גנטמיצין) כדי לנטרל חיידקים חוץ-תאיים באמצעות שטיפת פלטות אוטומטית (שטיפת 200 מיקרוליטר/גל באר).
   הערה: במהלך שטיפת עודף, שטיפת הפלטות האוטומטית מפזרת ושואף בינוני מדיום.
7. לבדיקת כניסה, יש לשטוף תאים בפעם השנייה עם DMEM/10% FCS המכילים 100 מיקרוגרם/מ"ל גרם ו-100 ננוגרם/מ"ל aTc באמצעות שטיפת לוחות אוטומטית (שטיפת 200 מיקרוליטר/גל באר).
8. אטמו את הפלטה עם Parafilm והחזירו אותה ללוח אלומיניום מחומם מראש באינקובטור לח של 37°C עם 5%_CO2 למשך 40 שעות או 4 שעות נוספות, לבדיקת נקודת הקצה ולבדיקת הכניסה, בהתאמה.
9. לצורך קיבוע, שטפו את הבארות עם PBS (מלח עם בופר זרחן) באמצעות שטיפת לוחות אוטומטית (שטיפת 200 מיקרוליטר/הצפה בבאר).
10. החלפת PBS עם 50 מיקרוליטר 3.7% פאראפורמלדהיד (PFA) ב-0.2 מטר HEPES ב-pH 7.4 באמצעות שטיפת לוחות אוטומטית.
    הערה: זהירות: PFA רעיל בשאיפה, במגע עם העור, ואם נבלע.
11. דגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
12. החלף את מדיום הקיבוע עם 50 מיקרו-ליטר PBS באמצעות מכונת שטיפת לוחות אוטומטית.
    הערה: הדגימות מוכנות כעת להוצאה מה-BSL3 במידת הצורך.
    אזהרה: הסרת כל דגימה ממתקן BSL3 (רמת בטיחות ביולוגית 3) כפופה להערכת סיכונים ואימות של ההליך ותלויה בתקנות החלות בתחום הבטיחות הביולוגית.

2. צביעה

1. שטוף תאים פעמיים עם 50 מיקרוליטר PBS.
2. חדירת תאים ב-50 מיקרוליטר 0.1% טריטון-X-100 ב-PBS למשך 10 דקות.
3. שטוף תאים שלוש פעמים עם PBS. הוסיפו 20 מיקרו-ליטר של PBS המכילים 1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול) ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
4. שטוף תאים שלוש פעמים ב-PBS והגן על הכתמים מאור עם נייר אלומיניום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מרק סויה טריפטי (TSB)	פלוקה	22092
סולפט קאנמיצין	סיגמא-אלדריץ'	60615
בקבוק פקק בורג בנפח 250 מ"ל	קורנינג	8396
DMEM	סיגמא-אלדריץ'	D5796
סרום עגל עובר (FCS)	גיבקו	10270	מושבתת חום
לוח באר 384 של גריינר CELLSTAR	סיגמא-אלדריץ'	M2062
נייר אלומיניום מתקלף	קוסטאר	6570
מפזר ריאגנט: "מתקן ריאגנטים Multidrop 384"	תרמו-סיינטיפיק	5840150	ניתן להשתמש במפזר מגיב חלופי.
תגובת טרנספקציה: "ליפופקטמין RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
שטיפת פלטות אוטומטית: "Plate washer ELx50-16"	ביו-טק	ELX5016	מכונת שטיפת לוחות זו כוללת סעפת 16 ערוצים המתאימה לפלטות עם 384 בארות. הוא נכנס לארון בטיחות ביולוגית ויש לו מכסה שמכסה את הצלחת בזמן הכביסה, מה שמפחית את הסיכון לייצור אירוסולים. ניתן להשתמש במכשירי שטיפה חלופיים עם תכונות דומות.
גנטמיצין	סיגמא-אלדריץ'	G1397
PBS	גיבקו	20012
פאראפורמלדהיד	סיגמא-אלדריץ'	P6148	התמוסס בבופר HEPES של 0.2 מטר, pH 7.4. אחסן בטמפרטורה של מינוס 20°C והפשר טרי יום לפני השימוש. זהירות, PFA רעיל בשאיפה, במגע עם העור ואם נבלע.
HEPES	סיגמא-אלדריץ'	H3375
טריטון X-100	סיגמא-אלדריץ'	T9284
DAPI	רוש	10236276001
Kif11 siRNA	דהרמקון	L-003317-00
ARPC3 siRNA	דהרמקון	L-005284-00
ברוצלה אבורדוס 2308
הלה CCL-2	ATCC	CCL-2
ImageXpress Micro	מכשירים מולקולריים	IXM IMAGING MSCOPE	מיקרוסקופ הדמיה תאית אוטומטי המצויד בשלב Z ממונע ומדויק. ניתן להשתמש במערכות חלופיות למיקרוסקופיה אוטומטית ורכיבים חלופיים למיקרוסקופיה קשה ותוכנה המפורטים להלן.