זיהוי רגישות לאנטיביוטיקה חיידקית באמצעות מיקרוסקופ פיזור ראמן מגורה

תקציר

מקור: ז'אנג, מ. ואח', בדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית מהירה באמצעות הדמיית פיזור ראמן מגורה של שילוב דויטריום בחיידק יחיד. J. Vis. Exp. (2022)

הסרטון הזה מדגים את השימוש במיקרוסקופ פיזור רמאן המגרה להערכת רגישות לאנטיביוטיקה על ידי מעקב אחר פעילות מטבולית מסומנת בדויטריום. על ידי ניטור אותות פחמן-דויטריום, השיטה מאפשרת זיהוי מהיר של אוכלוסיות חיידקים עמידות ורגישות.

פרוטוקול

1. D₂O טיפול בשילוב בנוכחות אנטיביוטיקה (איור 1א)

1. בדוק את ריכוז החיידקים על ידי מדידת צפיפות אופטית (OD) באמצעות פוטומטר באורך גל של 600 ננומטר.
2. מדלל את תמיסת החיידקים באמצעות מדיום רגיל של מולר-הינטון (MHB), שאינו מכיל דויטריום, כדי להגיע לריכוז תא סופי של 8 x 10⁵ CFU/mL. מערבוב עדין לערבוב תאי החיידק.
3. הכינו 300 מיקרו-ליטר אליקואטים של תמיסת החיידקים בשבעה מיקרו-צינורות בנפח 1.5 מ"ל, ו-600 מיקרו-ליטר אליקוטים של תמיסת החיידקים במיקרופופרת אחת בנפח 1.5 מ"ל.
4. הוסיפו 4.8 מיקרוליטר של תמיסת אנטיביוטיקה (גנטמצין או אמוקסיצילין) (1 מ"ג/מ"ל) לצינור המיקרו המכיל 600 מיקרו-ליטר מהתמיסה החיידקית, כדי להגיע לריכוז האנטיביוטי הסופי ל-8 מיקרוגרם/מ"ל.
5. יש לקחת 300 מיקרו-ליטר תמיסה מתוך 8 מיקרוגרם/מ"ל של תמיסת חיידקים המכילה אנטיביוטיקה, והוסף לעוד 300 מיקרוליטר תמיסת חיידקים, כדי ליצור תמיסת חיידקים מדוללת כפולה (4 מיקרוגרם/מ"ל).
6. חזור על הדילול הסדרתי הדו-כיפי של האנטיביוטיקה של הבדיקה, ג'נטמיצין או אמוקסיצילין, עד שמגיע למיקרו צינור עם הריכוז הנמוך ביותר (0.25 מיקרוגרם/מ"ל), ולהשליך 300 מיקרוליטר מהצינור. עבור גנטמצין ואמוקסיצילין, הריכוזים הסדרתיים נעים בין 0.25 מיקרוגרם/מ"ל ל-8 מיקרוגרם/מ"ל.
   1. השאירו צינור אחד ללא אנטיביוטיקה לשליטה ריקה. זו תהיה הבקרה החיובית לבדיקת פעילות מטבולית חיידקית ללא טיפול באנטיביוטיקה אך עם טיפול ב-D_2O.
   2. השאירו צינור אחד ללא אנטיביוטיקה וללא D₂O בשביל הביקורת השלילית.
7. דגרו את האליקו החיידקי עם אנטיביוטיקה מסוימת (גנטמצין או אמוקסיצילין) המכילה מדיום MHB למשך שעה.
8. במהלך הדגירה, יש להכין דילול סדרתי של אנטיביוטיקה עם מדיום המכיל 100% D₂O עם אותו גרדיאנט ריכוז של אנטיביוטיקה שהוכנה בשלב 1.6. עבור גנטמצין ואמוקסיצילין, הריכוזים הסדרתיים נעים בין 0.25 מיקרוגרם/מ"ל ל-8 מיקרוגרם/מ"ל.
9. לאחר שעה של טיפול באנטיביוטיקה, הוסף 700 מיקרוליטר של אנטיביוטיקה מדוללת סדרתית ו-100% מדיום MHB המכיל_D2O, ל-300 מיקרוליטר של חיידקים שטופלו מראש באנטיביוטיקה באותו ריכוז אנטיביוטי (הוכן בשלב 1.6), בהתאמה.
   1. לדוגמה, הוסף 700 מיקרוליטר של מדיום MHB המכיל 100% D₂Ox (המכיל 8 מיקרוגרם/מ"ל אנטיביוטיקה) ל-300 מיקרוליטר של 8 מיקרוגרם/מ"ל חיידקים מטופלים מראש באנטיביוטיקה. באותו אופן, העבר לצינורות המתאימים בריכוז הבא, והומוגניזציה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.
   2. הוסף 700 מיקרוליטר של מדיום MHB המכיל 100% D₂O, ללא אנטיביוטיקה, ל-300 מיקרוליטר של חיידקים ללא אנטיביוטיקה (מוכנים בשלב 1.6.1) כבקרה ריקה.
   3. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר דגירה במהירות 200 סל"ד למשך 30 דקות נוספות.
      הערה: בשלב זה, הריכוז הסופי של D₂O במדיום לבדיקה הוא 70%.
10. ראשית צנטריפוגה של 1 מ"ל אנטיביוטיקה ודגימת חיידק מטופלת ב-D₂O בטמפרטורה של 6200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, ואז שטוף פעמיים במים מטוהרים. לבסוף, מקבע דגימות בתמיסת פורמלין של 10% ואחסן אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. דימות פיזור ראמן (SRS) מעורר של שילוב מטבולי של D₂O בחיידק יחיד

1. שטוף 1 מ"ל של תמיסת חיידקים קבועה במים מטוהרים ואז צנטריפוגה בטמפרטורה של 6200 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנאנט. העשירו את תמיסת החיידקים לכ-20 מיקרוליטר.
2. הפקדו את תמיסת החיידקים על זכוכית כיסוי מצופה פולי-אל-ליזין. סנדוויץ' ואטום את הדגימה להדמיית SRS.
3. חיידקים מדמים בתדר רטט C-D ב-2168 ס"מ-1 באמצעות מיקרוסקופ SRS.
   1. הזן וכוון את אורך הגל של המשאבה ל-852 ננומטר באמצעות תוכנת הבקרה במחשב.
   2. מדוד את עוצמת הלייזר באמצעות מד כוח. כוונו את עוצמת הלייזר של המשאבה בדגימה ל-~8 mW ואת עוצמת Stokes Laser בדגימה ל-~40 mW על ידי כוונון לוח חצי הגל שלפני יציאת הלייזר.
      הערה: במיקרוסקופ SRS, לייזר פמטו-שניות הניתן לכוונון עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ מספק את לייזרי העירור של משאבה (680 עד 1300 ננומטר) ולייזרי עירור סטוקס (1045 ננומטר).
4. על ידי כוונון הברגים של מראות ההחזרה, יישר במרחב את המשאבה וקרני סטוקס ומכוון את שתי הקרניים למיקרוסקופ עומד המצויד במערכת מראות גלבו דו-ממדית לסריקת לייזר.
   1. השתמש במטרת טבילה במים של 60x כדי למקד את המשאבה ולייזרי סטוקס על הדגימה.
   2. השתמש במעבה שמן כדי לאסוף את האותות מהדגימה בכיוון קדימה.
   3. השתמש במסנן פס כדי לסנן את לייזר סטוקס לפני שאתה מכוון אותו לפוטודיודה.
   4. חלצו את אות רמאן המגרה באמצעות מגבר נעילה וזיהוי האותות באמצעות פוטודיודה.
5. הגדר כל תמונת SRS שתכיל 200 על 200 פיקסלים ואת זמן השהייה של הפיקסלים ל-30 מיקרושניות בלוח הבקרה של התוכנה. זמן הרכישה הכולל לתמונה אחת הוא ~1.2 שניות. הגדר את גודל השלב ל-150 ננומטר, כך שגודל התמונה הוא בערך 30 על 30 מיקרון^מרובע (2). תמו לפחות שלושה שדות ראייה לכל דגימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מודולציה אקוסטו-אופטית	גוץ' והאוסגו	R15180-1.06-LTD	מודולציה של קרן לייזר מפעילה
אמוקסיצילין	סיגמא אולדריץ'	A8523-5G
מסנן פס	כרומה	HQ825/150m	חסום את קרן הלייזר של הסטוקס לפני הפוטודיאודה
כלוריד סידן	סיגמא אולדריץ'	C1016-100G	התאמת קטיון
מרק מולר-הינטון מותאם לקטיון	פישר סיינטיפיק	B12322	בדיקת רגישות אנטימיקרוביאלית למיקרואורגניזמים באמצעות שיטות דילול מרק
צנטריפוגה	תרמו-סיינטיפיק	75002542
משקפי כיסוי	VWR	16004-318
צינור תרבית עם מכסה סנאפ	מותג פישר	149569B
תחמוצת דויטריום		151882	ממס אורגני להמסה של אנטיביוטיקה
דויטריום אוקסיד-d6	סיגמא אולדריץ'	156914	ממס אורגני כסטנדרט לכיול מערכת הדמיה SRS
אשריכיה קולי BW 25113	מרכז המלאי הגנטי של קולי	7636
צינורות מיקרוצנטריפוגה פוליפרופילן אפנדורף 1.5 מ"ל	מותג פישר	05-408-129
ג'נטמיצין סולפט	סיגמא אולדריץ'	G4918
פילטרים הידרופיליים פוליווינילידין פלואוריד	מיליפור-סיגמא	SLSV025NB	גודל נקבוביות 5 מיקרון
InSight DeepSee לייזר פולסים פמטו-שניות	ספקטרה-פיזיקה	מודל: insight X3	מקור לייזר ניתן לכיוון ומקור לייזר קבוע ב-1045 ננומטר להדמיית SRS
מגבר נעילה	כלי ציריך	HF2LI	דמודולציה של אותות SRS
מעבה שמן	אולימפוס	U-AAC	NA 1.4
פסאודומונס אארוגינוסה ATCC 47085 (PAO1)	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 47085
פוטודיאודה	המאמאצו	S3994-01	גלאי
צינור קוני פוליפרופילן 15 מ"ל	פלקון	14-959-53A
מסנני פוליפרופילן	תרמו-סיינטיפיק	726-2520	גודל נקבוביות 0.2 מיקרון
צלחות פטרי סטריליות	קורנינג	07-202-031
מזרק 10 מ"ל	מותג פישר	14955459
ספקטרופוטומטר UV/Vis	בקמן קולטר	דגם: DU 530	מדידת צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר
מערבל מערבולת	VWR	97043-562
מטרת מים	אולימפוס	UPLANAPO/IR	60×, NA 1.2