הקמת זיהום חיידקי בזחלי דרוזופילה

תקציר

מקור: הירויאסו, א., ד ' ואחרים, חילוץ המוציטים מזחלי דרוזופילה מלנגסטר לזיהום מיקרוביאלי וניתוח. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון הזה מדגים את התהליך ליצירת זיהום חיידקי בזחלי דרוזופילה על ידי הכנסתם לטיפה חיידקית ודקירתם עם מחט טונגסטן. הזחלים מודגרים לאחר מכן על צלחת אגר מחורצת ועשירה בחומרים מזינים כדי לחקור אינטראקציות בין מארח לפתוגנים.

פרוטוקול

1. זיהום בתוך ה-vivo

1. חממו את צלחת אגר מיץ הפירות דרוזופילה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
   1. הוסף 30 גרם אגר ל-700 מ"ל מים ואוטוקלווה למשך 40 דקות.
   2. המיס 0.5 גרם מתיל פרבן ב-10 מ"ל אתנול אבסולוטי.
   3. הוסיפו את תמיסת מתיל פרבן ל-300 מ"ל של ריכוז מיץ פירות.
   4. מערבבים במהירות את ריכוז המיץ לתמיסת האגר האוטוקלבית ומפזרים 5 מ"ל ל-10 × פטרי צלחות בגודל 35 מ"מ.
   5. לאחר שהצלחות התקררו ל-15 דקות, שמרו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
2. הכינו זחלים בשלב השלישי.
3. הנח את משחת השמרים על צלחת אגר. בצע חיתוך דק בפלטת האגר שבה הזחלים יכולים לנדוד כדי למנוע ייבוש (איור 1A). הרכיבו מחט טונגסטן מחודדת בקוטר 0.001 מ"מ עם מלקחיים מחזיקים באמצעות סרט פרפין (איור 1B, C).
4. פיפט 50 מיקרוליטר של קוקסייה ברנטי mCherry עם טיטר גבוה (5.95×10⁹ GE/mL) על שכבת הפרפין תחת מיקרוסקופ סטריאו ומניחים את הזחלים בבריכת החיידקים.
5. מניחים את הזחלים בבריכת החיידקים, דוקרים אותם עם מחט טונגסטן (איור 3D), והעבירו אותם לפלטת אגר (איור 1E).
6. העבר את מדיום הפתוגן שנותר אל לוח האגר ואטום את הפלטה עם שכבת פרפין.
7. השאירו את הזחלים על הצלחת באוויר לח עד הזמן הרצוי לאחר ההדבקה (איור 1F). בניסוי זה, זחלים שנדבקו ב-C. burnetii נמצאים על הפלטה במשך 24 שעות.

תוצאות

איור 1: זיהום בתוך החיים. א) צלחות אגר של מיץ פירות דרוזופילה ומשחת שמרים משמשים לדגירת זחלים נגועים ב-invivo . חיתוכים נעשים בלוח האגר כדי להקל על אריכות החיים של הזחל (חצים אפורים). ב) מחט טונגסטן מחודדת בקוטר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ סטריאו	אמסקופ	SM-1BSZ-L6W
מלקחיים	VWR	82027-402
Coxiella burnetii - mCherry	ד"ר היינזן, ר.
צלחות מיץ פירות דרוזופילה	פרוטוקולי קולד ספרינג הארבור		http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
אגר	ביוריאגנטים של פישר	BP1423-500
מתיל פאראבן	אמרסקו	0572-500G
אתנול מוחלט	ביוריאגנטים של פישר	BP2818-500
ריכוז קפוא במיץ ענבים 100% של וולץ', 340 מ"ל	אמזון	B0025UJVGM
צלחות פטרי, 10 על 35 מ"מ	פישר סיינטיפיק	08-757-100A
שמרים, אופים מיובשים פעילים	ביומדיקל MP	210140001	הוסף 2 חלקי מים לחלק אחד של שמרים (v/v)
מחט טונגסטן	כלי המדע המדויק	10130-20
החזקת מלקחיים	VWR	HS8313
ליסטריה מונוציטוגנס	ATCC	עווץ: 10403S	זן Listeria monocytogenes 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) גודל במרק Difco Brain-heart infusion (BHI) (BD Biosciences) המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.