הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של המוציטים נגועים בפתוגנים של דרוזופילה

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: הירויאסו, א., ואחרים. חילוץ המוציטים מזחלי דרוזופילה מלנגסטר לצורך זיהום וניתוח מיקרוביאלי. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים הדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה של המוציטים Drosophila melanogaster שנדבקו ב-Coxiella burnetii כדי להמחיש את מיקום הפתוגן בתלת-ממד, ומאפשר ניתוח מפורט של דינמיקת זיהום תוך-תאית ואינטראקציות בין מארח לפתוגן.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדמיה קונפוקלית
1. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי להדמיה תלת-צבעונית של DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole), EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר) ו-mCherry. השתמש בהגדרה הבאה: עירור DAPI (למשל) 405 ננומטר, פליטה (em) 415-480 ננומטר; EGFP ex 488 ננומטר, EM 493-564 ננומטר; mCherry ex 587 ננומטר, EM 597-700 ננומטר.
2. הנח את הדגימה על המיקרוסקופ והתמקד בדגימה באמצעות מטרה של 63X/1.4 מספרי (NA). אתר את ההמוציטים הרצויים בשדה הראייה להדמיה.
3. כוון את עוצמת הלייזר ואת הרווחים של הגלאי כדי להשיג חשיפה מתאימה לדגימה. בדוק כמה מישורי z כדי לוודא שרמת החשיפה מתאימה לכל עובי הדגימה.
4. מצא את המיקומים העליונים והתחתונים על ציר ה-z של המוציט שלם. הגדר את המיקומים הללו כנקודות התחלה וסיום לחתך z.
5. השתמש בזום סריקה רק כדי לצלם את האזור שבו נמצא ההמוציט. פקטורי זום של 3X משמשים לעיתים קרובות.
6. אספו את סדרת התמונות ברזולוציה מתאימה, כגון 1024 x 1024 פיקסלים במישור x-y, ורווח של 0.3 מיקרון בממד z.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם

חברה

מספר קטלוג

הערות

Coxiella burnetii - mCherry

ד"ר היינזן, ר.

זכוכית כיסוי מיקרוסקופ

פישר סיינטיפיק

12-545-80

4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול

תרמו פישר סיינטיפיק

62247

מיקרוסופה קונפוקלית

לייקה

מיקרוסקופ סורקת לייזר קונפוקלי באור לבן TCS SP8-X

שקופיות מיקרוסקופ

פישר סיינטיפיק

12-552-3

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

מאמרים קשורים