ניתוח ביטוי גנים בתא יחיד מפתוגנים שמופקים על ידי צמחים

תקציר

מקור: רופיאן, י. ס. ואחרים. ניתוח תא יחיד של ביטוי גני Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים שיטה לניתוח ביטוי גנים בחיידקים פתוגניים שמופקים מצמחים ברמת תא יחיד באמצעות פקטור שעתוק פלואורסצנטי. הדמיה קונפוקלית חושפת הטרוגניות בביטוי גנים של אלימות, ומדגיש גיוון פונקציונלי בתוך אוכלוסיית חיידקים משובטים.

פרוטוקול

1. ניתוח תא יחיד של החיידקים המופקים מאפופלסט

1. הכינו תמיסת אגרוז של 1.5% במים מזוקקים. לאחר ההימסה, הוסף מספיק נפח כדי למלא את החלל בין שני שקופיות מיקרוסקופיות המונחות זה לצד זה והנח שקופית נוספת מעליה (איור 1). תן להם להתייבש 15 דקות ולהסיר בזהירות את המחסנית שמונחת למעלה. באמצעות להב, חתכו את כרית האגרוז לחתיכות בגודל 5 מ"מ על 5 מ"מ ממש לפני השימוש.
2. במקביל, צנטריפוגה של 1 מ"ל מהחיידק המופק מאפופלסט בעוצמה של 12,000 x גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר, מסירים בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה, ומחזירים את הכדור ל-20 מיקרו ליטר מים לריכוז התאים. הנח טיפה של 2 מיקרוליטר של התאים המרוכזים על כיסוי בגודל 0.17 מ"מ וכסה את הטיפה בחתיכה בגודל 5 מ"מ על 5 מ"מ של כרית האגרוז שהושגה קודם בשלב 1, כפי שמוצג באיור 1.
3. הדמיינו את ההכנה החיידנית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי (ראו טבלת חומרים). לזיהוי חיידקים ירוקים-פלואורסצנטיים, השתמשו בלייזר העירור ב-488 ננומטר ובמסנן פליטה בטווח של 500 ננומטר עד 550 ננומטר. כדי לזהות את כל החיידקים, השתמש בשדה הבהיר וממזג את שני השדות.
4. עיבוד התמונות הקונפוקליות באמצעות פיג'י (ראו טבלת חומרים). לשם כך, השתמשו בתוסף MicrobeJ כדי לזהות את קווי המתאר של תא החיידקים ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנציה שבתוכו.
   הערה: מומלץ לבצע רכישת תמונה מחיידקים מבודדים (לא מקובץ) לניתוח זה.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של ההגדרה וההכנה של משטח האגר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כיסוי 0.17 מ"מ			אין דרישות מיוחדות
רשת מתכת 1.6 x 1.6 מ"מ	בוזיפו		רשת רשת פיברגלס
צינורות קוניים של 50 מ"ל	סארסטדט
אגרוז	מרק
מיקרוסקופ קונפוקלי סטלריס	לייקה מיקרוסיסטמס
תוכנת פיג'י