מודל המעי במבחנה להערכת הידבקות ואינטרנליזציה של חיידקים

תקציר

מקור: קלטאיוד ארויו, מ., ואחרים. הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקים סינתטי בממשק המארח-מיקרוב המעי במבחנה. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים מודל של מארח-מיקרוב במעי במבחנה לחקר חיוניות חיידקים. קו-קולטורה של תאי Caco-2 ו-HT29-MTX מדוגרת עם חיידקים שעברו טיפול מוקדם בתנאי עיכול מדומים. שלמות מחסום האפיתל מוערכת באמצעות התנגדות חשמלית טרנס-אפיתליאלית, וחלקים מהתווך, הריר הממס, הליזאט התא ושאריות התא נאספים לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

1. זנים ותנאי תרבות

הערה: קהילת הפה הסינתטית הורכבה מזנים הנפוצים במיקרוביום הפה.

1. קבלו את הזנים הבאים מאוסף תרבות הסוגים האמריקאית (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987), ו-Streptococcus mitis (ATCC 49456).
2. רכש Veillonella parvula ממכון לייבניץ DSMZ-האוסף הגרמני למיקרואורגניזמים ותרביות תאים (DSM 2007), Streptococcus sanguinis מאוסף החיידקים BCCM/LMG (LMG 14657), ושימוש בזן Streptococcus salivarius TOVE-R, ו-Streptococcus oralis.

2. פיתוח קהילה רב-מינים המייצגת את המיקרוביום הפאלי

הערה: יצירת קהילה סינתטית לדמות את יכולת ההיצמדות הפוטנציאלית של חיידקי הפה לאפיתל המעי במבחנה . גידול חיידקים על לוחות אגר בדם עם תוספת של 5 מיקרוגרם/מ"ל המין, 1 מיקרוגרם/מ"ל מנדיון, ו-5% דם סוס דפיברינט סטרילי. בקצרה:

1. המיס 100 מ"ג מין ב-2 מ"ל של 1 מ' נתרן הידרוקסיד (NaOH), והוסף 100 מ"ל מים מזוקקים עם אוטוקלב. אחסנו במיכל כהה. סטריליזציה דרך פילטר של 0.22 מיקרון לפני הוספה למדיום.
2. המיס 100 מ"ג מנדיון ב-20 מ"ל של 96% אתנול. סטריליזציה דרך פילטר של 0.22 מיקרון לפני הוספה למדיום.
3. הכינו 1 ליטר מדיום אגר דם (ראו טבלת חומרים) בהתאם להוראות היצרן ולאוטוקלאב. תן לזה להתקרר לפני שמוסיפים את דם הסוס ואת התוספים. ערבבו ושפכו את הצלחות.
4. הכינו מרק הזרקת מוח ולב (BHI) מותאמת. הוסף 5 מיקרוגרם/מ"ל של מין ו-1 מיקרוגרם/מ"ל מנדיון לאחר האוטוקלב.
5. יש לחלק 9 מ"ל מהמדיום בצינורות Hungate, ולסגור עם פקק גומי ומכסה אלומיניום. שטוף את הצינורות בחנקן/פחמן דו-חמצני או_N2/CO₂ (90%/10%).
6. אסוף 1 מ"ל של מדיום אנאירובי עם מזרק ומניח אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל. בחר מושבות בודדות מכל מין חיידק, מרחף מחדש בתווך, ומעביר חזרה ל-BHI האנאירובי המותאם בחזרה. דגרו במשך 48 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, למעט S. salivarius, שצריך לדגור במשך 24 שעות.
7. במידת הצורך, אשר את טוהר התרביות לפני הרכבת הקהילה הסינתטית. בקצרה:
   1. חילוץ DNA מהתרביות הנוזליות והגברת גן 16S rRNA באמצעות הפריימרים 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) ו-1492R (TACGGYTACCTTGTTACGACT), והתוכנית הבאה: 5 דקות ב-95 מעלות צלזיוס, 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, 55 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת, ו-72 מעלות צלזיוס למשך 1.5 דקות, ואחריהם שלב הארכה סופי של 5 דקות בטמפרטורה של 72 מעלות צלזיוס.
   2. לטהר את מוצר תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) באמצעות ערכה מסחרית (ראו טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
   3. בצע את תגובת הריצוף של התוצרים המטוהרים בנפח כולל של 10 מיקרוליטר המכיל 0.5 מיקרוליטר צבע (ראו טבלת חומרים), 3.2 pmol של פריימר M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2.0 מיקרוליטר של בופר ריצוף פי 5, ו-20 ng של תבנית, באמצעות מערכת ריצוף מסחרית עם ערכה (ראו טבלת חומרים).
      הערה: עברנו את ההליך הזה באופן מסחרי.
   4. בצע חיפוש BLAST על כל הרצפים (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) כדי לקבוע את הטקסון הקרוב ביותר הידוע ולהשוות עם רצף הזן המקורי באמצעות כלי RDP Classifier מקוון (http://rdp.cme.msu.edu/) ושירות יישור SINA (https://www.arb-silva.de/aligner/).
8. מדדו את מספר התאים בסוף הדגירה, באמצעות ציטומטריית זרימה וצבע SYBR Green/Propidium Iodide. מדלל את התרביות ל-10^תאים בגודל ^mL-1, באמצעות BHI מותאם.
9. הוסף 1 מ"ל של S. mitis לתוך 75 מ"ל של BHI אנאירובי ודגר עד לשלב הסטציונרי (6 שעות). לאחר מכן, אספו 0.75 מ"ל מכל זן מדולל וערבבו בתנאים אנאירוביים.
10. לאחר שכל התרביות מעורבבות, קחו 1 מ"ל מהמיקרוקוסמוס, והוסיפו ל-75 מ"ל BHI. דגרו את הקהילה הסינתטית תחת 10%_CO2, 10% מימן (_H2), 80% N, למשך 48 שעות ב-37 °C ו-200 סל"ד (ראו טבלת חומרים).
11. מדדו צפיפות תאים כמו ב-2.8. לפני הצגת הקהילה למודל התא. הרכב הקהילה ניתן להערכה באמצעות PCR בזמן אמת כמותי. בנוסף, יש להשתמש בריצוף אמפליקונים של גן 16S rRNA כדי לספק מידע על החברים הראשונים שהיו נוכחים. לכל אחד מהפרוטוקולים לאישור זהות, השתמש ב-cDNA כתבנית לציון החיידקים המתמללים באופן פעיל חלבונים, והשתמש ב-DNA כתבנית לחשוף את נוכחות/היעדר הזנים.

3. שיטות תרביות תאים כלליות

הערה: יש להשיג קווי תאים המשמשים מהאוסף האירופי של תרביות תאים מאומתות (Caco-2 ECACC 86010202 ו-HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, בריטניה). ניתן לרכוש חומרים לתרבות תאים (ראו טבלת חומרים), אלא אם צוין אחרת.

1. תחזוקה והעברת קווי תאי Caco-2 ו-HT29-MTX הערה: תאי Caco-2 ו-HT29-MTX גדלים באופן שגרתי בבקבוקי תרביות רקמה בגודל 25 ס"^{מ 2} המכילים את מדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) (טבלה 1). תאים עוברים טריפסיניזציה כאשר מגיעים ל-60–70% מפגש הגוף.
   1. הסר את מדיום תרבית התאים מהבקבוקונים. שטוף פעמיים עם 5 מ"ל PBS בלי סידן/מגנזיום (Ca⁺⁺/Mg⁺⁺).
   2. הוסף 2 מ"ל של תמיסת 0.5 מ"ג לליטר של טריפסין ו-0.22 גרם לליטר אתילן דיאמין טטראצטית (EDTA). פזר את תמיסת הטריפסין על ידי הזזת הבקבוק בעדינות. הסר 1.5 מ"ל מתמיסת הטריפסין ודוגר את הבקבוק בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   3. בדוק תחת מיקרוסקופ אם תאים מנותקים משטח הבקבוק. דגרו עוד 5 דקות, אם צריך.
   4. הוסף 5 מ"ל של חומר תרבית תאים מושלמת לבקבוק כדי לנטרל את הטריפסין. פיפט למעלה ולמטה כדי לקבל תלייה חד-תאית הומוגנית.
   5. מיד, קחו אליקוט של 50 מיקרו-ליטר של תליית התא וערבבו עם תמיסת Trypan Blue סטרילית של 0.4% ביחס של 1:1 (v/v) לתאי Caco-2 או 1:5 v/v עבור HT29-MTX. ערבבו על ידי פיפטינג וטעינה לתא ספירה (ראו טבלת חומרים).
   6. ספרו את התאים הבריאים (תאים לבנים ובהירים) תחת המיקרוסקופ (ראו הוראות היצרן).
   7. זרע בבקבוק חדש בצפיפות של 4 x 10⁵ תאים/ס"^{מ 2} ו-1 x 10⁴ תאים/ס"^{מ 2}, עבור Caco-2 ו-HT29-MTX, בהתאמה.
      הערה: (1) תאי Caco-2 מתמיינים ויוצרים חיבורים הדוקים לאחר שמגיעים לחיבור האחד. חשוב מאוד להימנע מהתנגשות יתר לפני הטריפסיניזציה. גדילה יתר של תאים בבקבוק עלולה לגרום לכישלון בהיפרדות התאים לאחר טריפסיניזציה ו/או הצטברות תאים. (2) תאי HT29-MTX הם תאים המייצרים ריר עם פעילות מטבולית גבוהה. תכונות אלו עלולות לגרום לחמצון מהיר של תווית תרבית התאים, במיוחד אם התאים בצפיפות גבוהה. ניתן להוסיף בופר 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפראזיניאתןסולפוניק (HEPES) לתווך תרבית התאים (טבלה 1) כדי לשמור על ה-pH בין 7 ל-7.2. אם ה-pH יורד, ניתן להחליף את המדיום כאשר המפגש נמוך מ-50%. עם זאת, אם החיבור >50%, יש לפצל את תרבית התאים.

4. הרכבת מודל תא רב-תחומי המדמה את ממשק המארח-מיקרוב של המעי

הערה: השלים את הקו-קולטורה בבארות תא כפולות (קוטר 24 מ"מ, גודל נקבוביות 0.4 מיקרון; ראו טבלת חומרים).

1. הוסיפו 1.5 מ"ל של מדיה מלאה של תרבית תאים לתא האפיקלי ו-2 מ"ל לתא הבסיסי. יש להדגיר מראש למשך 20–30 דקות כדי לקבל התפלגות אחידה של תליית התא בעת הזרעה.
2. טריפסיניזציה של תרבית התאים של Caco-2 ו-HT29-MTX כפי שמתואר בסעיף 3. יש לבצע את הליך הטריפסיניזציה במדויק כדי להשיג פיזור הומוגני של שני קווי התאים, בתנאי תא יחיד, ללא גושים.
3. ספרו את התאים הבריים כפי שמתואר ב-3.1.8.
4. כוון את צפיפות התאים ל-6.5 x 10⁴ תאים/סמ^{"ר ביחס} של 90/10 לתאי Caco-2/HT29-MTX.
5. הומוגניזציה של תעלות התא והוספה את הנפח המתאים של תאי Caco-2 ו-HT29-MTX למיכל סטרילי ממולא מראש עם מדיה לתרבות תאים מושלמת. הסר את המדיה המוקדמת מראש מהצד האפיקלי של החדר באמצעות שאיפה.
6. מערבבים בעדינות את מתלה התא באמצעות פיפטינג, והעבירו 1.5 מ"ל לתא האפיקלי של הכנסות לתא. תהליך הזריעה דורש הומוגניזציה מתמדת של תליית התא, שכן התאים נוטים לשקוע. בהתאם לחוויית המשתמש ולמהירות העבודה, יש לערבב את מתלי התא לאחר שחרור 1–3 בארות.
7. הזז את הלוחות בעדינות קדימה ואחורה ואז ימין לשמאל לימין (5–10 פעמים) כדי לקבל פיזור אחיד של התאים בבאר. העבר לאינקובטור וחזור על תנועת הלוחות.
8. שמרו על קו-קולטורציה של תאי Caco-2/HT29-MTX למשך 15 ימים, תוך רענון התאים האפיקליים והבסיסיים כל יומיים עם תוספת DMEM. לאחר תקופה זו, ניתן להחליף את מדיום תרבית התאים ל-DMEM עם תוספת ללא תמיסה אנטיביוטית/אנטי-מיקוטית.
9. שמרו על המערכת עד 20–21 ימים לאחר הזריעה על ידי רענון המדיום כל יומיים.
10. מדדו את שלמות מחסום האפיתל לפני תחילת הבדיקה, באמצעות מערכת התנגדות חשמלית (ראו טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
    1. ודאו שציוד ההתנגדות החשמלית הטרנסאפיתלית (TEER) טעון במלואו (>24 שעות) לפני תחילת המדידות.
    2. נתק את ציוד ה-TEER מספק הכוח והמכסה עם שקית פלסטיק של אוטוקלאב. תעשה חור בשקית כדי להכניס את האלקטרודה ותחבר ליציאת הכניסה במד. רסס 70% אתנול/מים (v/v) לפני הכנסת ציוד ה-TEER לארון הזרימה.
    3. כדי לחטא את האלקטרודה, טבלו את קצות האלקטרודה בתמיסה של 70% אתנול/מים (v/v) למשך 15 דקות. תן לו להתייבש באוויר במשך 15 שניות. שטוף את האלקטרודה במדיה של תרבית תאים מחוממת מראש.
    4. הוצא את התאים מהאינקובטור ותן לתאים להגיע לטמפרטורת החדר בתוך ארון הזרימה.
    5. ודא שהמד מנותק מהמטען. הגדר את מתג המצב לאוהם והפעל את מתג ההפעלה.
    6. מדדו את התנגדות התא על ידי הטבלת האלקטרודה עם הקצה הקצר יותר באינסרט והקצה הארוך מחוץ לבאר. שמור על האלקטרודה בזווית של 90° להכניסה של הלוח.

5. הישרדות חיידקים לאחר תנאי מעבר מעיים במבחנה

הערה: הכינו את כל הדילול במים אולטרה-טהורים. סנן את כל התמיסות באמצעות פילטר של 0.22 מיקרון ובצע את תהליך העיכול בתנאים סטריליים.

1. עיכול אוראלי:
   1. הניחו 3 מ"ל מהקהילה החיידקית בצינור סטרילי בנפח 50 מ"ל, ערבבו עם 3 מ"ל נוזל רוק מדומה (SSF), המכיל (ב-MMOL ^L-1): כלוריד אשלגן (KCl), 15.1; אשלגן די-הידרוגן פוספט (KH₂PO₄), 3.7; נתרן ביקרבונט (NaHCO₃), 6.8; מגנזיום כלוריד הקסהידרט [MgCl₂(H₂O)₆], 0.5, פחמימות אמוניום [(NH₄) CO₃], 0.06; חומצה כלורית (HCl), 1.1; סידן כלוריד דיהידרט [CaCl₂(H₂O)₂], 0.75. הוסף 75 U/mL של α-אמילאז מרוק אנושי מסוג IX-A ו-2 גרם לליטר מוצין מקיבת חזיר סוג II ל-SSF.
   2. דגרו את התערובת למשך 2 דקות ב-37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד. אסוף דגימה של 2 מ"ל לצורך חילוץ DNA וכימות ציטומטריית זרימה (S1).
2. עיכול קיבה:
   1. הוסף 4 מ"ל של נוזל קיבה מדומה (SGF), המכיל (ב-mmol L-1): KCl, 6.9; KH₂PO₄, 0.9; NaHCO₃, 25; נתרן כלוריד (NaCl), 47.2; MgCl₂(H₂O)₆, 0.1; (NH₄)CO₃, 0.5; HCl, 15.6; CaCl₂(H₂O)₂, 0.075. בנוסף, ה-SGF הכיל 2 גרם לליטר מוסין מקיבת חזיר סוג II.
   2. מדוד את ה-pH והתאים ל-pH 3 עם 1 M HCl, אם צריך. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד. אסוף דגימה של 2 מ"ל (S2).
3. עיכול במעי הדק:
   1. הוסף 4 מ"ל של נוזל מעי מדומה (SIF) המכיל (ב-MMOL L-1): KCl, 6.8; KH₂PO₄, 0.8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38.4; MgCl₂(H₂O)₆, 0.33; HCl, 8.4; CaCl₂(H₂O)₂, 0.3, לצינור העיכול.
   2. כוון ל-pH 7 עם 1 M NaOH, אם צריך. דגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-100 סל"ד. אסוף דגימה של 2 מ"ל (S3).

6. יכולת קולוניזציה חיידקית לאחר תנאי מעבר מעיים במבחנה

1. צנטריפוגה של 2 מ"ל מעי דק למשך 10 דקות בעוצמה של 2,650 x גרם.
2. הסר את הסופרנטנט וערבב את הכדור החיידקי עם 5 מ"ל DMEM עם תוספת ללא אנטיביוטיקה ואנטימיקוטיים.
3. צבע וכמת תאים שלמים/פגומים באמצעות ציטומטר זרימה (ראו טבלת חומרים).
4. כוונן את צפיפות התאים ל-10-5 תאים ברי קיימא למ"ל על ידי דילול בתוספת DMEM ללא אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה.
5. הסר את המדיום האפיקלי של מערכת הטרנסוול והוסף 1.5 מ"ל של השעון החיידקי. קו-קולטורציה של המערכת במשך 2 שעות בתנאי תרבית תאים כלליים (37 מעלות צלזיוס, 95% לחות, 5%_CO2).
   הערה: זמן זה יכול להיות מוארך עד 48 שעות, בהתאם לפרוטוקול הניסוי הנדרש. ניתן לשמור את הקו-קולטורה באינקובטור שונה מזה המשמש לתחזוקה שגרתית של התאים, כדי למנוע זיהומים.
6. מדדו את ערכי ה-TEER לאחר הדגירה כדי להעריך את שלמות מחסום האפיתל כפי שמתואר ב-4.11.
7. לאחר סיום זמן הדגירה, הסרת המדיה האפיקלית ואיסוף 0.5 מ"ל לניתוחים נוספים (S4). ניתן להשתמש בתת-דגימה של מדיה להערכת שרי-קיימא של תאים באמצעות בדיקת לקטט דהירוקנאז (LDH) (ראו טבלת חומרים), בהתאם להוראות היצרן.
8. הוסיפו 0.5 מ"ל של 10 מ"מ N-אצטילציסטאין ב-HBSS (NAC-buffer) כדי להמיס את הריר המופק על ידי HT29-MTX ולשחזר חיידקים דביקים שנדבקו. דגרו את הלוחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה, תחת ערבוב (135 סל"ד, ראו טבלת חומרים).
9. לשחזר את ה-NAC-HBSS בצינור מיקרוצנטריפוגה (S5) ולשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל DPBS.
10. הוסיפו 0.5 מ"ל של 0.5% טריטון X-100 (עם וייט) מעל השכבות המונולריות, הפרעו לתאים על ידי פיפטינג, שחזרו את הנוזל, ויצרו מערבולת למשך דקה. מהירות היא קריטית כדי להימנע מפגיעה בתאי החיידקים עם הדטרגנה.
11. צנטריפוגה את התאים למשך 5 דקות בעוצמה של 2,650 x g, והפרדו את הסופרנטנט (S6) והכדור (S7).

7. ניתוח דגימות

הערה: ניתוח דגימות שנאספו (S1-S7) להערכת חיוניות חיידקים ופוטנציאל ההידבקות לתאי המעי, לאחר עיכול מדומה במערכת העיכול.

1. חיוניות חיידקים: העבירו דגימות S1-S5 פעמיים דרך מסנן של 0.45 מיקרון וכימות תאי חיידק באמצעות צביעת תאים חיים/מתים וציטומטריית זרימה, כפי שמצוין בשלב 2.8.
2. פוטנציאל הידבקות: הכינו דילול סדרתי (-1 עד -8) עבור S1-S6 וצרו פסים של 10 מיקרוליטר באגר דם ולוחות BHI מותאמים. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתנאים אנאירוביים למשך 24–48 שעות. לוחח את אותו נפח של S7 לא מדולל.
   1. זיהוי טקסונומי של חיידקים דבוקים לשם:
      1. בחר מושבות בודדות עם לולאת תרביות ותשהה כל אחת ב-10 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. אוספים 4 מיקרו-ליטר של השעיה זו והשתמשו בה כתבנית להגברת PCR של גן 16S rRNA באמצעות הפריימרים והתנאים המתוארים ב-2.7.1.
      2. לבצע ריצוף לפי הפרוטוקול ב-2.7.3, ואימות הרצף באמצעות ההליך הכלול ב-2.7.4.
3. בצע ניתוחים נוספים בהמשך כגון חילוץ DNA כולל, כימות qPCR, ו/או ריצוף אמפליקונים של 16S rRNA, חילוץ RNA ופרופיל טרנסקריפטומי לפי הצורך.
   הערה: כימות ציטומטריית זרימה בוצע מיד לאחר הדגימה. כאמצעי בקרה לתאים חדירי ממברנה, נעשה שימוש בדגימה שנחשפה ל-70 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. רעש רקע הוערך על ידי מדידת נוזלי העיכול או דגימות שנאספו ממודל תרבית התאים באמצעות ציטומטריית זרימה, ללא חיידקים. כל דגימה נמדדה בשלושה עותקים.

 

טבלה 1: תיאור קווי התאים והרכב המדיה לתחזוקת תרבית התאים.

תרבית תאים	דבק/השעיה	מדיום גידול	תוספות כלליות	תוספות ספציפיות	הכפלת הזמן	תנאי דגירה
CACO-2 (ECACC 86010202)	תומך	מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco עם 4.5 גרם גלוקוז לליטר	סרום בקר עוברי מושבת (10% v/v) פניצילין (100 U/mL)* סטרפטומיצין (0.1 mg/mL)* אמפוטריצין (0.0025 mg/mL)*	גלוטמקס (4 מ"מ) חומצות אמינו לא חיוניות (1% v/v) פירובט (1 מ"מ)	65–72 ה'	95% לחות ו-10% חממת CO2 CO2 (ראו טבלת חומרים)
HT29-MTX (ECACC 12040401)	תומך			HEPES (1 mM)	20–24 שעות
* אנטיביוטיקה ואנטי-פטרייתיות הוסרו ממדיית תרבית התאים יומיים לפני תחילת הבדיקות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
זנים
Aggregatibacter actinomycetemcomitans	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 43718
Fusobacterium nucleatum	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 10953
Porphyromonas gingivalis	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 33277
Prevotella intermedia	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 25611
סטרפטוקוקוס מוטנס	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 25175
סטרפטוקוקוס סוברינוס	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 33478
אקטינומיצס ויסקוזוס	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 15987
Streptococcus salivarius TOVE-R
סטרפטוקוקוס מיטיס	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 49456
סטרפטוקוקוס סנגוויניס	אוסף חיידקים BCCM/LMG	LMG 14657
Veillonella parvula	מכון לייבניץ DSMZ - אוסף מיקרואורגניזמים ותרביות תאים גרמנית	DSM 2007
סטרפטוקוקוס גורדוני	אוסף תרבות הטיפוס האמריקאית	ATCC 49818
קווי תאים
תאי Caco-2	אוסף אירופי של תרביות תאים מאומתות	86010202
תאי HT29-MTX	אוסף אירופי של תרביות תאים מאומתות	12040401
חומרים מתכלים וחומרים מתכלים
מרק עירוי מוח לב (BHI)	אוקסואיד	CM1135
בלאד אגר 2	אוקסואיד	CM0055	מדיום אגר דם
מנדיונה	סיגמא	M9429
המין	סיגמא	H9039
5% דם סוס סטרילי עם דפיברינציה	מעבדות E&O בע"מ,	P030
ערכת InnuPREP PCRpure	אנליטיק ינה	845-KS-5010250	ערכת טיהור PCR
צבע גדול	מערכות ביולוגיות יישומיות	4337454	צבע לרצף
ערכת רצף מחזורים ABI Prism BigDye Terminator v3.1	מערכות ביולוגיות יישומיות	4337456
SYBR גרין I	Invitrogen	S7585
פרופידיום יודיד	Invitrogen	P1304MP
בקבוקי תרבית T25 לא מצופים, מטופלים בתרבות תאים, מאווררים, סטריליים	VWR	734-2311
פתרון Trypsin-EDTA	סיגמא-אלדריץ'	T3924-100ML
תמיסת Trypan Blue 0.4%, נוזלית, מסוננת סטרילית	סיגמא-אלדריץ'	T8154
מזרח-מלוח (PBS)	גיבקו	14190250
מדיום תרבית תאי DMEM, עם GlutaMAX ו-Pyruvate	טכנולוגיות חיים	31966-047
תוספות תרבית תאי ממברנה של Corning Transwell פוליאסטר	סיגמא-אלדריץ'	CLS3450-24EA
מוטין מקיבת חזיר סוג II	סיגמא-אלדריץ'	M2378
סרום בקר עוברי מושבת	גריינר ביו וואן	758093
אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X)	גיבקו	15240062
טריטון X 100 לביולוגיה מולקולרית	סיגמא-אלדריץ'	T8787
DPBS ללא סידן, מגנזיום	גיבקו	14190-250
ערכת בדיקת ציטוטוקסיות של Pierce LDH	תרמו פישר סיינטיפיק	88953
באר Corning HTS Transwell-24, גודל נקבובית 0.4 מיקרון	קורנינג קוסטאר קורפ	3450
מים ללא נוקלאז	אלקטרופורזה סרווה	28539010
ציוד
חדר הספירה של נויבאואר משופר	קארל רות'	T729.1
ציטומטר זרימה BD Accuri C6	BD ביוסיינסס	653118
PowerLyzer 24 Homogenizer	מוביו	13155
T100 Thermal Cycler	BioRad	186-1096
מערכת שטיפה	בהתאמה אישית	-
מנער אינקובטור InnOva 4080	ניו ברונסוויק סיינטיפיק	8261-30-1007	שייקר ל-2.10
חממת CO₂ ממרט	Memmert GmbH & Co.	ICO150med
מערכת ההתנגדות החשמלית (Millicell ERS)	EMD מיליפור, מרק KGaA	MERS00002
מיליפור מילי-קיו, מערכת מים טהורה במיוחד	מיליפור, מרק KGaA	-
שייקר (ROCKER 3D בסיסי)	איקה	4000000	שייקר ל-6.10