$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. בידוד DNA גנומי מרקמת צמח באמצעות ערכת חילוץ גנומית
- השגת רקמת עלי הדר על ידי חיתוך עלה טרי שלם מעץ הדרים באמצעות מספריים נקיים, והנח את העלה בשקית סנדוויץ' פלסטיק נקייה.
הערה: השקית המכילה את רקמת העלה צריכה להיות מונחת במקרר בטמפרטורה של 4°C או על קרח במיכל מבודד בהקדם האפשרי לאחר האיסוף כדי למנוע קלקול. - הוסיפו כמות קטנה של חנקן נוזלי כדי לקרר את המלט והעלי. בזמן הקירור, השתמש במספריים כדי לחתוך חתיכת רקמת עלים קטנה, בגודל של כ-1 אינץ' רבוע. הנח את הרקמה החתוכה במלט כדי להקפיא אותו מיד. הוסף עוד חנקן נוזלי, אם צריך.
הערה: יש תמיד ללבוש כפפות מבודדות בעת טיפול בחנקן נוזלי. - טחנו במהירות את רקמת הצמח לאבקה דקה באמצעות המלט. המשיכו לטחון עד שהחנקן הנוזלי מתאדה לחלוטין, ונשארת אבקה ירוקה דקה.
- קרר לזמן קצר מרית מתכת בחנקן נוזלי למשך 10 - 15 שניות, ואז גרף את רקמת הטחון בתוך המלט לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל, באמצעות המרית.
- הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת פירוק גרעינים (ראו טבלת חומרים) באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר. מערבל את הדגימה למשך 1 עד 3 שניות, ואז דגר באמבט מים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- מוסיפים 3 מיקרוליטר תמיסת RNase לליזאט באמצעות פיפטה של 10 מיקרוליטר, הפכו את הצינור 2-5 פעמים לערבוב, ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור ארון למשך 15 דקות.
הערה: תן לתערובת להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שממשיכים. - הוסיפו 200 מיקרוליטר של תמיסת משקעים חלבונים, מערבולת במהירות גבוהה למשך 20 שניות, ואז צנטריפוגה ל-3 דקות ב-13,000 x גרם ליצירת כדור מוצק. בזמן שהדגימה עוברת צנטריפוגה, הוסף 600 מיקרול איזופרופנול בטמפרטורת החדר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל.
- באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, הסר בזהירות את הסופרנטנט מהדגימה הצנטריפוגית, והעבירו לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי בנפח 1.5 מ"ל המכיל איזופרופנול. כעת ניתן להשליך את הכדור.
הערה: הימנעו מזיהום הסופרנטנט בחלבון על ידי השארת כמות זעירה של סופרנטנט מעל הכדור. - הפוך את הצינור עד שה-DNA נראה כמסה של חוטים דמויי חוט, ואז צנטריפוגה בעוצמה של 13,000 x g למשך דקה בטמפרטורת החדר.
- שחרור הסופרנטנט, הוסף 600 מיקרוליטר של 70% אתנול לכדור, הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את ה-DNA, וצנטריפוגה ב-13,000 x גרם למשך דקה.
- שאפו בזהירות את האתנול, השאירו את כדור ה-DNA הרופף, ואז פתחו והפכו את הצינור, מונח על נייר סופג. לייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הידרציה לכדור ה-DNA היבש, ואז דגר את ה-DNA באמבט מים בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה, תוך ערבוב תקופתי על ידי נגיעה בצינור.
- הנח 1 מיקרולטר מים מטוהרים במיקרוקובטה, והכנס אותם לספקטרופוטומטר לשימוש כרקן. מחשב את ריכוז ה-DNA הקיים על ידי הנחת 1 מיקרוליטר של הדגימה במיקרוקובטה והחדרה לספקטרופוטומטר. ריכוז ה-DNA (ng/μL) ניתן לחישוב כ-(A260 - A320) × מקדם דילול × 50 ng/μL.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. ניתן לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.