מאמר שיטה

מסלולי לימוד Cell רולינג על דפוסי קולטן אסימטרית

DOI:

10.3791/2640

⸱

13 בפברואר 2011

 ,  ,  ,  , 
1Department of Materials Science and Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Mechanical Engineering, MIT - Massachusetts Institute of Technology, 3HST Center for Biomedical Engineering and Harvard Stem Cell Institute, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים פרוטוקול להתבונן ולנתח מסלולי מתגלגל תאים על מצעים בדוגמת אסימטרית הקולטן. את הנתונים המתקבלים שימושיים ההנדסה של הקולטן בדוגמת מצעים להפרדה-תווית חינם התא ניתוח.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תזוזה רוחבית של תאים אורתוגונליים כדי להזרים זרם על ידי גלגול על דפוסי קולטן אסימטרית מהווה הזדמנות לפיתוח של מכשירים חדשים ההפרדה תווית חינם ניתוח של תאים 1. מכשירים כאלה עשויים להשתמש תזוזה לרוחב הפרדה רצוף זרימה, או דפוסי קולטן כי לווסת הידבקות להבחין בין פנוטיפים תאים שונים או רמות של ביטוי הקולטן. הבנת טבעה של מסלולי מתגלגל על ​​קולטן תא בדוגמת מצעים הכרחי ההנדסה של מצעים ועיצוב של מכשירים כאלה.

הנה, אנחנו מדגימים פרוטוקול לחקר מסלולי התא מתגלגל על דפוסי קולטן אסימטרית התומכים הידבקות התא מתגלגל 2. מוגדרים היטב, מיקרומטר בקנה מידה דפוסי P-selectin רצפטורים היו מפוברקות באמצעות הדפסה microcontact על מצופה זהב שקופיות שולבו בחדר זרימה. HL60 תאים המבטאים את ליגנד PSGL-1 3 היו זרמו על פני השדה של קווים בדוגמת ו דמיינו על הפוך מיקרוסקופ שדה בהיר. התאים התגלגל מסומנים בשולי נוטה דפוסים, וכתוצאה מכך סטיה לרוחב 1. כל תא התגלגל בדרך כלל במרחק מסוים לאורך שולי התבנית (כהגדרתו אורך מעקב קצה), מנותקת מן הקצה, והעלה שוב לדפוס במורד הזרם. למרות ניתוק זה מקשה לעקוב אחר מסלול שלם של תא מהכניסה ליציאה בחדר זרימה, חלקיק מעקב התוכנה שימשה לנתח התשואה מסלולי גלגול של התאים בתקופה שבה הם נעים על קולטן אחד בדוגמת קו. מסלולי נבדקו ואז לקבל הפצות של גלגול מהירויות התא אורכי קצה מעקב עבור כל תא של דפוסים שונים.

פרוטוקול זה שימושי לכימות מסלולים תא מתגלגל על ​​דפוסי הקולטן הקשור אלה פרמטרים הנדסיים כגון זווית דפוס מתח גזירה. נתונים אלה יהיה שימושי עבור העיצוב של התקנים microfluidic להפרדת-תווית חינם התא ניתוח.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HL60 תא מתגלגל

1.1. המצאה של Patterned מצעים.

  1. באמצעות הדפסה microcontact (μCP) 4-7 לבצע לסירוגין עצמית התאספו monolayers (Sams) של מולקולות PEG על מצופה זהב שקופיות הזכוכית: לפברק הדפסה microcontact polydimethylsiloxane (PDMS) חותמות אשר הגדיר את דפוסי קולטן עם זווית הנטייה של α = 10 ° על ידי תהליך SU 8 דפוס. נקו את משטח זהב עם פתרון פיראניה (03:01 תערובת של חומצה גופרתית על חמצן ומימן 30%) למשך 20 דקות ולאחר מכן לשטוף את המשטח עם מים די שופע ב 24.5 מעלות לפני השימוש. דיו חותמת PDMS עם פתרון PEG 5mm באתנול. יבש חותמת באוויר במשך 20 דקות. בעדינות לשים את החותמת על פני השטח זהב עבור 40 שניות ולוודא שיש מגע טוב בין משטח זהב חותמת. אין לחץ עודף נדרשת. יש לשטוף את המשטח עם אתנול לייבש אותו תחת זרם של N 2.
  2. דגירה המצע בתוך פתרון P-selectin (15 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב DPBS) באמצעות תא זלוף (מדעי מיקרוסקופית אלקטרונים) במשך 3 שעות ב 24.5 ° C לדפוס אזורים שנותרו עם selectin-P. יש לשטוף את המשטח עם DPBS שופע.
  3. למילוי השטח עם ארגון ה-BSA (1 מ"ג / מ"ל ​​ב DPBS) עבור h 1 לחסום הלא ספציפית אינטראקציות. יש לשטוף את המשטח עם DPBS שופע.

1.2. תא רולינג ניסויים בחדר זרימה.

  1. תזרים השעיה של HL60 תאים (~ 10 5 תאים / מ"ל) על משטחים בדוגמת בתא תזרים מלבני (Glycotech, Inc; רוחב w = 1.0 ס"מ, אורך = 6 ס"מ, גובה h = 0.0127 ס"מ) על 24.5 ° C. השתמש משאבת מזרק (Precision Instruments העולם, SP230IW) כדי לייצר קצב הזרימה של μL 75 / דקה, עם הלחץ גזירה המקביל סביב 0.5 dyn / 2 ס"מ (~ 0.05 אבא). חישוב מתח גזירה τ באמצעות מטוס תזרים Poiseuille המשוואה τ = 6μQ/wh 2, שם μ הוא צמיגות kinematic (0.001002 אבא ים), Q הוא קצב הזרימה volumetric, W הוא רוחב של תא הזרימה, h הוא גובה תא זרימה.
  2. שימוש במיקרוסקופ הפוכה (ניקון TE2000-U) עם מצלמה רכוב (אנדור iXon 885) כדי להקליט HL60 תאים המתגלגל אינטראקציות עם P-selectin מצעים דבק באמצעות 4 × אובייקטיבי, בדרך כלל בשיעור של 1 מסגרת לשנייה עבור משכי זמן של 300 s. בצעו שלושה ניסויים עצמאיים, עבור כל גודל הלחץ גזירה ונטייה זווית דפוס. מוצגים נתונים כמו סטייה ממוצעת ורמת הערכים הממוצע המתקבל כל ניסוי.
  3. ניתוח נתונים.
    נתח את התמונה sequences על ידי תוכנית אישית (Mathworks, Inc) Matlab כי נוצלו חלקיק מעקב 8 freeware ליצור מסלולים בשולי קו בדוגמת. שירים להאריך עד סוף הלהקה P-selectin נבחרו מצויד בשני מגזרים קו ישר - אחד מיושר עם הזרם, השני מיושר עם קצה דפוס. שני אלה משמשים מגזרים אז כדי לחשב את אורך מעקב קצה, מהירות גלגול על הקצה, וגלגול מהירות על האזור רגיל.

2. נציג תוצאות:

figure-protocol-1
איור (א) מראה אחד של תמונות מיקרוסקופ המרה וידאו של HL60 אינטראקציות מתגלגל עם P-selectin מצעים דבק באמצעות אובייקטיבי 4 ×. אזורים בהירים וכהים מתאימות קולטן P-selectin ואזורים PEG, בהתאמה. איור (ב) מציג את המסלולים מתקבל באמצעות תוכנית אישית Matlab. זווית הנטייה קצה היה 10 ° ואת הלחץ גזירה היה 0.5 dyn / 2 ס"מ. מעקב קצה אורך, אני הדואר, עקירה, d, ואת מהירויות מתגלגל על קצה ובתוך להקות, V ו-V e p, בהתאמה, מתוארים באיור (C-1). איור (C-2) מראה את הפצה (מספר תאים מוקלט) אורך מעקב קצה. ריבועי להראות את הערך הממוצע של l דואר ואת מהירות מתגלגל על קצה (V ה) ובתוך להקות (V p) בזווית הנטייה α = 10 ° ואת גודל נוזל מתח גזירה סביב 0.5 dyn / 2 ס"מ. ברים שגיאה מייצגים סטיית תקן אחת, כאשר n = 3 ניסויים לשכפל (3 משטחים לשכפל) עבור כל תנאי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תיארנו פרוטוקול לבחון מסלולים מתגלגל על קולטן תא בדוגמת משטחים סימטריים מפוברק באמצעות הדפסה microcontact 2. התמונות מיקרוסקופ אופטי של פני השטח בדוגמת מראה בניגוד ברור בין PEG ו-P-selectin אזורים ניתן להשתמש כדי לאשר הטבעה מוצלחת. שארפ, ישרות ניתן לראות כאשר ביול מבוצע היטב. קשה הקשה של הבול עלול לגרום לעיוות חותמת אשר מגביל את הדיוק של דפוסים. קצוות גלית ניתן לקבל כאשר ריכוז דיו גבוה מדי או זמן ביול ארוכה מדי. קשר רע בין הבול לבין המשטח מוביל לא אחידה דפוסי PEG כאשר ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה מומן על ידי מרכז Deshpande עבור חדשנות טכנולוגית ב-MIT (ר.ק. ו JMK) ואת אות הקריירה NSF 0952493 עד ר.ק. דרך כימי וביולוגי תוכנית הפרדות. אנו מודים המכון ננוטכנולוגיות חייל (ISN) לבין טכנולוגיה Microsystems מעבדה (MTL) ב-MIT עבור שימוש במתקנים שלהם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי לוקמיה פרומיאלוקיטית אנושייםATCCCCL-240תאי HL60
שקופיות זכוכית מצופות זהבEMFTA134שקופיות זהב
(1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol)Sigma-Aldrich674508PEG
P-selectin אנושי רקומביננטיR&D SystemsADP3-050P-selectin
אלבמין משרת בקרRockland ImmunochemicalsBSA-50BSA
סריסן פוספט עם בופר של Dulbecco’Mediatech, Inc.21-030DPBS
חומצה גופריתSigma-Aldrich339741
מי חמצןSigma-Aldrich316989

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
  2. Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
  3. Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
  4. Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
  5. James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
  6. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
  7. Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
  8. Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
  9. Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
  10. Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
  11. Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
  12. Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Microcontact PrintingP selectinHL60

מאמרים קשורים