אפיון פיזיולוגיים, מורפולוגי והעצבית של נוירונים מווסתת על ידי תנועת

סיכום

הטכניקה מתוארת לכמת את בתגובה פיזיולוגית vivo של נוירונים יונקים במהלך התנועה לתאם את הפיזיולוגיה של הנוירון עם מורפולוגיה העצבית, פנוטיפ neurochemical ו microcircuitry הסינפטי.

תקציר

תפקידו של נוירונים בודדים והתפקוד שלהם מעגלים עצביים הוא היסוד להבנת מנגנונים עצביים של פונקציות החושי והמוטורי. רוב החקירות של מנגנוני הסנסורית להסתמך על בדיקה או של נוירונים בעוד חיה הוא ^1,2 סטטי או פעילות תאית שיא העצבית במהלך תנועה. ^3,4 בעוד מחקרים אלו סיפקו את הרקע הבסיסי לתפקוד הסנסורית, הם גם לא להעריך מידע פונקציונלי אשר מתרחשת במהלך תנועה או מוגבלים ביכולתם מלא לאפיין את הפנוטיפ, אנטומיה פיזיולוגיה neurochemical של הנוירון. טכניקה מוצג כאן המאפשרת אפיון נרחב של נוירונים בודדים במהלך בתנועה vivo. טכניקה זו יכולה לשמש לא רק ללמוד הנוירונים מביא העיקרי, אלא גם לאפיין motoneurons ו interneurons הסנסורית. בתחילה התגובה של נוירון בודד נרשם בשיטות אלקטרו במהלך התנועות של הלסת התחתונה ואחריו להגדרה של שדה פתוח עבור הנוירון. נותב עצביים לאחר מכן מוזרק intracellularly לתוך תא העצב לבין המוח מעובד כך הנוירון ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ אור, אלקטרונים או confocal (איור 1). מורפולוגיה מפורט של הנוירון מאופיין הוא שיחזר אז כך מורפולוגיה העצבית יכולה להיות בקורלציה עם התגובה הפיזיולוגית של נוירון (איורים 2,3). בתקשורת זה פרטים מפתח חשוב טיפים ליישום מוצלח של טכניקה זו מסופקים. פרטים נוספים המוערכים ניתן לקבוע עבור נוירון הנחקרת על ידי שילוב שיטה זו עם שיטות אחרות. תיוג העצבית מדרדר ניתן להשתמש כדי לקבוע נוירונים עם סינפסות שבו נוירון שכותרתו: נחישות ובכך מאפשר מפורט של מעגלים עצביים. Immunocytochemistry ניתן לשלב עם שיטה זו לבחון נוירוטרנסמיטורים בתוך הנוירון שכותרתו כדי לקבוע את פנוטיפים הכימי של הנוירונים שבה צמתי נוירונים שכותרתו. הנוירון שכותרתו יכול גם להיות מעובד עבור במיקרוסקופ אלקטרונים כדי לקבוע את התכונות ultrastructural ו microcircuitry של הנוירון המסומן. בסך הכל טכניקה זו היא שיטה רבת עוצמה ביסודיות לאפיין נוירונים במהלך בתנועה vivo ובכך מאפשר תובנה משמעותית לתוך תפקיד של הנוירון בתפקוד הסנסורית.

פרוטוקול

1. הכנת בעלי חיים

1. הרדימי עכברוש עם נתרן pentobarbital (IP 50mg/kg) ומניחים על משטח חימום. לגלח את העור המכסה את הגולגולת האחורי עם קוצץ בעלי חיים. בדוק את בעלי החיים כדי להבטיח רמה כירורגית של רמת הרדמה התקבל על ידי בדיקת העדר רפלקס נסיגה הניקוד כאשר האצבעות הן צבט כמו גם העדר רפלקס palpebral. בדוק את רמת הרדמה כל 15 דקות לשמור על רמה כירורגית של anesthetisa על ידי זריקות של 15mg/kg נתרן pentobarbital כל 45 דקות.
2. השתמש בטכניקה aseptic ולעשות חתך באזור המפשעה דיסטלי רק כדי הקפל שנוצר על ידי הבטן והירך הפנימית להוסיף צינורית (1 מ"מ קוטר, קליי אדמס) לתוך וריד הירך, והוא עורק הירך. ביצוע חתך קו האמצע באזור submandibular, משקפים את השרירים infrahyoid. ביצוע חתך קטן קנה הנשימה להוסיף צינורית (2 מ"מ קוטר), כדי לאפשר אוורור. טיי תפר סביב trachael cannual לאבטח אותו בלחץ הדם הדיאסטולי מערכתית place.Monitor ו הסיסטולי דרך צינורית העורקים. בנוסף ניטור נסיגה רפלקס palpebral כעת לנטר את לחץ הדם על מנת להעריך את רמת הרדמה. ניהול הרדמה נוספות בעת הצורך דרך צינורית ורידי.
3. מניחים את חולדה לתוך מסגרת stereotaxic ולבצע craniotomy לחשוף את המוח הקטן. חבר את צינורית לקנה הנשימה אל הנשמה מכרסמים. לאוורר את חיה עם נפח של 2 ס"מ ³ בקצב של 100/min עם אוויר humidified. לחץ חיובי בסוף הנשיפה של 1 ס"מ H ₂ O יש לשמור כדי למנוע התמוטטות ריאה. כל 15 דקות hyperinflate לריאות כדי למנוע atelectasis. ואז לכסות את פני השטח של המוח עם שמן מינרלי מחומם (30 מעלות צלזיוס). היזהר, כדי למנוע את סינוס ורידי גדול הממוקם ישירות מתחת לצומת בין הקודקודית ועצמות interparietal.
4. החל דבק cyanoacrylate למוט מצמידים את הויברטור אלקטרומגנטי ולצרף את המוט diastema של הלסת. הזז את הלסת התחתונה אותות באמצעות הפקודה כדי ויברטור מ או פלט / מחשב D או מחולל אותות.
5. מניחים siliver-כסף כלוריד אלקטרודה הארקה מתחת לעור הסמוך craniotomy.

2. אלקטרודה הכנה

1. לפברק microelectrodes מ זכוכית קוורץ או aluminosilicate באמצעות חולץ microelectrode אופקי.
2. מלאו את microelectrode עם biotinamide 5-10% מומס 0.25M KCl ו 0.5m טריס HCl חיץ (pH 7.6) או tetramethlyrhodamine 2% מלח (pH 6). בדוק עכבה אלקטרודה אלקטרודה עם הבוחן. כדי להקליט מן האקסונים בקוטר גדול להפוך אלקטרודות עם עכבה של 60-80m Ω, עבור אקסונים קטנים interneurons לעשות אלקטרודות עם עכבה של 80 150MΩ.
3. מניחים את microelectrode לשלב ראש electrometer. דמיינו את האלקטרודה מבעד לטלסקופ קטן (20X עם reticle סגורה), אשר מקובע בעמדה מאחורי הראש של החיה. באמצעות הטלסקופ חשוב משום שהוא מאפשר אלקטרודות להיות ממוצבת stereotaxically בדייקנות רבה.

3. הקלטה אלקטרו והכתים תאיים

1. הפוך את פתח קטן מאטר פיא מפצים את המשוב קיבול, כך שכאשר האלקטרודה נוגעת המוח אות משוב מיוצר. זה מאפשר מיקום מדויק של פני השטח של המוח.
2. תוצרת עקירה mandibular חזר ולקדם את האלקטרודה לתוך המוח עם מנוע צעד.
3. להכיר impalements העצבית על ידי טיפות פתאומית פוטנציאל DC ולזהות impalements העצבית intrasomatic ידי פעילות סינפטית מתמשך. מזמזמים את האלקטרודה עם לפיצוי יתר של קיבול או הקשה לעתים רחוקות לייצר חדירה לתא מוצלח. בגלל העכבה הגבוהה של האלקטרודות, תגובות עצביות הם נצפו לעתים נדירות לפני החדירה.
4. לאחר לדקור תא עצב ואת החדירה נחשבת יציבה, לאפיין את התגובה העצבית באמצעות רמפה ארוכה ותנועה הלסת סינוסי. ⁵ מפת שדה פתוח של הנוירון ידי חיטוט העור סביב הראש תוך חלל הפה עם החללית הלא מוליך כגון מקל עץ. אם רלוונטי המחקר, לבחון את התגובה של הנוירון אחרים גירויים רלוונטיים מבחינה תפקודית כגון התכווצות שרירים גירוי מזיק. ראשיים מביא ⁶ קולטנים עצביים nociceptive להגיב לגירויים nociceptive. Anesthesetics כללי כגון נתרן pentobarbital לא לחסום את ההולכה axonal בנוירונים מביא העיקרי אלא לדכא את ההולכה הסינפטית. לפיכך הולכה axonal ב האקסון העיקרי העצבית מביא נשמר.
5. הזרק הנוכחי (DC, 1-4nA) במשך זמן הזרקה הכולל של 15-70nA דקות. צג חדירת האלקטרודה במהלך הזריקה הנוכחית ולהפסיק אם פוטנציאל הממברנה נהיה יותר חיובי-30mV.

4. עיבוד רקמות

1. להרדימו על ידי מינון יתר של pentobarbital (140mg/kg IV) perfuse עם כלי דם ולשטוף (0.9% NaCl 38 ° C המכיל 500 יחידות של הפרין ו 1ml 2% xylocaine ואחריו paraformaldehyde 4% ב 0.1M פוספט חיץ (pH 7.4) .
2. הסר את המוח סעיף זה ב 50-100μm באמצעות vibratome באחת המטוס, חזיתית sagittal או אופקי. Secions נאספים צף חופשי 25 ° C-PBS.
3. תהליך המוח DAB ידי דוגרים בסרום 1-2% עז רגיל 1% Triton X-100 ב 0.01M PBS ואחריו הדגירה ב avidin ביוטין מורכב (01:50 עלית Vectastain). להגיב חלקים באמצעות ניקל DAB עם H ₂ O _2. כדי תהליך טקסס האדום, חלקים דגירה avidin ב-ביוטין מורכב (01:50) ב-PBS לילה בשעה 4 ° C ו דגירה אז 4 ° C במשך הלילה 4% טקסס האדום avidin DCS ב PBST. Counterstain קטעים עם ניאון Nissl כתם (NeuroTrace) 20min ב 23 ° C.
4. אם נוירון הזריקו rhodamine, לדמיין את נוירון מוזרק ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אקס 545nm).

5. שילוב השיטה עם תיוג immunocytochemistry מדרדר, הדמיה confocal, ניתוח כמותי colocalization

ההצלחה של שילוב בטכניקה זו עם שיטות אחרות תלויה במידה רבה על תיוג תאיים טוב.

1. השיטה דמיינו כאן יכול בקלות להיות משולבת עם תיוג העצבית מדרדר. ^7-10 כדי לעשות זאת, להרדים את החיה באמצעות הטכניקה aseptic, להזריק נותב עצבי כגון peroxidase חזרת (20% peroxidase חזרת. Sigma השישי, Sigma) ו -1% נבט חיטה aggultinated peroxidase חזרת (Sigma) לאזורים היעד היקפי כגון שריר masseter. נותב זה העצבית יילקחו לתוך האקסונים הפריפריה מועבר באמצעות תחבורה axonal כדי somata motoneuron. עבור השריר masseter, 15μl של נותב מוזרק לתוך השריר באמצעות microsyringe סטרילי 10 microliter. בעלי חיים ממוקמות אז על כרית חימום במעקב עד התאושש מההרדמה והניח אז בכלובים שלהם להחלמה. לאחר 24 שעות, להרדים בעלי חיים פיזיולוגית לאפיין נוירונים intracellularly כתם אותם. אנקב את החיה כפי שתואר לעיל ורקמות סעיפים תהליך נוכחות של HRP באמצעות tetramethylbenzidine (TMB), כמו כרומגן ו tungstate נתרן כמו מייצב והתגברה עם קובלט. סעיפים מקום נתרן 1% tungstate מומס 0.1M PBS (pH 6.5) ו TMB 0.0007% מומס באתנול אצטון מוחלט על 15 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ואז להגיב סעיפים רקמה ידי הוספת 1.0 מ"ל של 0.3% H ₂ O ₂ לכל 100 מ"ל של תמיסת הדגירה של 60 דקות. לשטוף רקמות 0.1M PBS (pH 6.5) ומניחים diaminobenzidine 0.05% (pH 7.4), קובלט 0.02% ו 0.01% H ₂ O ₂ ב 0.1M PBS (pH 7.4) עבור 10 דקות. בשעה 37 ° C. תהליך הרקמה להדמיה של הנוירון הזריקו biotinamide כמתואר ולדמיין את יחסי הגומלין בין הנוירון חושית שכותרתו ועוד מגוון של motoneurons.
2. הטכניקה המוצגת כאן יכול גם בקלות להיות משולבת עם immnocytochemistry. ⁶ כדוגמה, immunocytochemically תהליך המוח synaptophysin במדויק לאתר סינפסות בתוך הנוירונים שכותרתו (איור 3). כדי לעשות זאת, דגירה חלקים במוח נוגדן אנטי synaptophysin העכבר (1:10,000) של 2 ימים 4 ° C ולאחר מכן מדגירים את האנטי עכבר FITC (1:400) עבור 1h על 23 ° C.
3. נוירונים שכותרתו עם סמנים ניאון או מעובדים דימות פלואורסצנטי הם אידיאליים עבור הדמיה confocal. איור 3 הוא דוגמה סעיף אופטי שהושגו עם מיקרוסקופיה confocal באוטון דרך האקסון. (איור 3). יצירת אנימציות של נוירונים שכותרתו באמצעות רכישת חלקים אופטיים מרובים באמצעות נוירון שכותרתו (איור 4).
4. נוירונים שכותרתו בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך ניתוח כמותי colocalization. כדי לעשות זאת, להשתמש במאקרו תוכנה זמינים לציבור בשיתוף עם NIH Image (למצוא http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htm). בתרגום synaptophysin בתוך מסופי האקסון אחת על ידי שילוב של תיוג תאיים עם immunocytochemistry synaptophysin. ⁶

6. נציג תוצאות:

סקירה של נציג את התוצאות שניתן להשיג בשיטה זו הם באיור 1. זה גזע המוח נוירון יחיד נרשם electrophysiologically במהלך התנועה של הלסת התחתונה, וכפי ניתן בבירור לראות את התגובה של נוירון זה (איור 1 השמאלית התחתונה, כחול בהיר) היה מווסת במהלך התנועה. נוירון זה היה מוזרק עם biotinamide לאחר אפיון אלקטרו ומעובד לאחר מכן להדמיה. נוירון משוחזר (1 איור באמצע, ירוק) יכול להיות אמיתיטד לציון אנטומית, במקרה זה הגרעין מנוע trigeminal המיועד (מתאר אדום). בהתבסס על התגובה העצבית במהלך התנועה ושיקום נוירון זו ניתן לזהות כ נוירון ציר משני שרירים מביא. איור 2 ממחיש דוגמה מייצגת של התגובה הפיזיולוגית של נוירון במהלך עקירה בלסת. התגובה של הנוירון מיוצג תדירות ירי מיידי. שים לב התגובה העצבית מקרוב מחקה תזוזה mandibular המעיד על כך נוירון מסוים מספק משוב תחושתי הקשורים במצבו mandibular. באיור 3 היא תמונה בהגדלה גבוהה של האקסון מוכתם intracellularly בשילוב עם מכתים עבור synaptophysin ו Nissl כתם. שים לב colocalization של synaptophysin (צהוב) בתוך באוטון האקסון. באיור 4 הוא הנפשה של נוירון יחיד, המאופיינת פיזיולוגית ומסומן intracellularly.

באיור 1. סקירה כללית של השיטה. העליון השמאלי: עקירה mandibular. הקלטה תאיים התיכון (ירוק) נוירון יחיד (צהוב). מורפולוגיה של נוירון זה שוחזר לאחר ההקלטה הזרקת תאיים. מתאר האדום מציין מיקום של גרעין מנוע trigeminal. התחתון השמאלי: התגובה הפיזיולוגית של נוירון זה במהלך התנועה הלסת.

איור 2. התגובה הפיזיולוגית נציג תא עצב שריר בודד חושית רשמה in vivo במהלך התנועה של הלסת התחתונה. הערה הדמיון של התגובה העצבית עם עקירה בלסת.

איור 3. Arborization Terminal axonal עם boutons הסינפטי (נפיחויות אדום) של נוירון intracellularly מוכתם חושי אשר הגיבו במהלך חיטוט שריר. לאחר עיבוד immunocytochemical עבור synaptophysin מראה לוקליזציה של synaptophysin בתוך באוטון axonal (צהוב). הירוק הוא Nissl פלורסנט הכתם.

איור 4. אנימציה של כישור השריר העיקרי האקסון נוירון אשר מביא פיזיולוגיים התגובה נרשמה in vivo במהלך התנועה mandibular, האקסון היה אז מוכתם intracellularly ומעובד להדמיה.
הורד וידיאו ברזולוציה גבוהה של איור 4 כאן
הורד וידיאו ברזולוציה בינונית של איור 4 כאן

דיון

השיטה מאויר כאן היא טכניקה רבת עוצמה אשר מספק תובנה חשובה לתוך הפונקציה של נוירונים בודדים איך התגובה של נוירונים בודדים תורם מעגלים עצביים. ⁹ הידע הזה הוא היסוד להבנת תפקוד הסנסורית. הכוח הגדול ביותר של טכניקה זו היא כי הוא מאפשר קביעה של מספר רב של פרמטרים על נוירון כולל פיזיולוגיה, מורפולוגיה ומורפולוגיה הפצה הסינפטי ו. בשילוב עם טכניקות אחרות כגון מידע מדרדר תיוג עצביים נוספים כגון מעגלים עצביים ניתן לאפיין. ^7,8 יתרון נוסף של שיטה זו הוא כי ניתן ללמוד צעד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב או ציוד	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
אלקטרומגנטית ויברטור	לינג Dynamic Systems	V101
האות גנרטור	מערכות משוב	PFG605	מסוגל לייצר אות פלט טרפז
אלקטרודת הזכוכית	סאטר מכשירים	AF100-68-10	עם נימה
אלקטרודה חולץ	סאטר מכשירים	דגם P-2000 או P-80
biotinamide	וקטור מעבדות	SP-1120	מאוחסן ב 4 ° C
טקסס האדום avidin DCS	וקטור מעבדות	A-2016
tetramethlyrhodamine	מולקולרית בדיקות	D-3308	3000 משקל מולקולרי, ליזין ניתן לתקן
עכבר אנטי synaptophysin נוגדן	Chemicon	MAB5258
פלורסנט Nissl כתם	Neurotrace, בדיקות מולקולריות	N-21480
אלקטרודה הבוחן	וינסטון אלקטרוניקה	BL-1000-B	כדי למדוד עכבה אלקטרודה
electrometer	אקסון מכשירים	Axoprobe 1A, Axoclamp 2B