מאמר שיטה

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti

15.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/2772

⸱

16 במאי 2011

 , 
1Department of Biology, University of Richmond

במאמר זה

סיכום

שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.

תקציר

יתושים הם וקטורים עבור מספר גורמי מחלות ומזיקים כגון וירוס קדחת צהובה, טפילי מלריה ותולעים filarial. מעבדות חוקרת אנטי הפתוגן מרכיבים של מערכת החיסון המולדת של וקטור מחלת מין בתקווה ליצור יתושים מהונדס, כי הם מגיבים פתוגנים כגון 1, 2. מערכת החיסון המולדת של יתושים כולל כמה שורות של הגנה 3. פתוגנים שמצליחים לברוח המכשול שהוטלו על ידי יתוש אפיתל מצופה midgut 4 להיכנס hemolymph והמפגש hemocytes במחזור, מרכיבים תאיים חשובים לתמצת פתוגנים לבלוע 5, 6. החוקרים לא מצאו ראיות רקמות hematopoietic ב יתושים ראיות הנוכחי עולה כי מספר hemocytes קבוע על הופעתה מבוגרים המספרים בפועל עשוי לרדת כפי הגילאים יתושים 7. היכולת לזהות כראוי לאסוף hemocytes מפני חרקים חשוב מבחינה רפואית היא צעד חיוני ללימודי חסינות הסלולר. עם זאת, גודלו הקטן של יתושים נפח מוגבל של hemolymph מהווים אתגר לאיסוף תאים חיסוניים.

שתי שיטות לאיסוף הוקמה hemocytes יתושים כולל גירוש hemolymph מתוך חוטם לחתוך 8, ועקירה נפח (זלוף), שבו מלוחים מוזרק באזור necklike קרומי בין הראש לבין החזה (כלומר, צוואר הרחם) לבין hemolymph perfused נאסף מפתיחת קרוע באזור הדיסטלי של הבטן 9, 10. טכניקות אלו, לעומת זאת, מוגבלים על ידי התאוששות נמוכה של hemocytes וזיהום אפשרי על ידי תאים שומן בגוף, בהתאמה 11. לאחרונה שיטה המכונה התאוששות הזרקה / התאוששות גבוהה משופרת של immunocytes על ידי שימוש מאגרים קרישה תוך הפחתת רמות זיהום קשקשים ורקמות פנימיות 11. אמנם שיטה המאפשרת שיטה משופרת של איסוף ושמירה hemocytes לתרבות העיקרי, הוא טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף שאינם נחוצים אם המטרה היא לאסוף את הזרם, לתקן כתם hemocytes עבור אבחון. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו של איסוף hemolymph יתוש המשלבת את הפשטות של זלוף, באמצעות מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח, עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים.

פרוטוקול

1. הכנות מוקדמות לאיסוף המוציטים

  1. הכינו תמיסת דילול להמולימף המורכבת מ-60% Schneider's Medium, ‏10% סרום עגל עוברי (FBS), ו-30% בופר ציטראט (נוגד קרישה; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM citric acid, pH 4.5) 11. הכינו אליקוטות של 1.0 mL שניתן לאחסן ב-20°C-. השתמשו בכל אליקוטה פעם אחת בלבד (ראו חומרים).
  2. הכינו זכוכית למשקוף מיקרוסקופ (75 x 25 x 1 mm) על ידי חריצת עיגול בקוטר 1 cm בקצה אחד באמצעות כלי לחריטת זכוכית. לחלופין, ניתן לרכוש זכוכית למשקוף עם שני עיגולים חרוטים מראש (למשל ממקורות Fisher Scientific או EMS). יידרש משקוף זכוכית אחד לכל יתוש.
  3. הכינו סט של מחטי זכוכית (ראו חומרים) שנמשכו לפי ההגדרות המוצעות הבאות (Sutter Instruments, Model P-87):
    Heat Ramp+5
    Pull: 45
    Vel: 75
    Time: 175
    Pressure 580

    באמצעות ההגדרות המוצעות במותח זה, אנו מכינים מחטים באורך כולל של כ-500 mm עם אורך גבעול של כ-3 mm. ניתן לרכוש גם מחטים שנמשכו מראש (למשל Tritech Research).

2. הכנת המיקרו-מזרק לפני איסוף ההמוציטים

  1. הכנס מחט משוכה למחזיק המחטים של המיקרו-מזרק בהתאם להוראות היצרן. מלא לאחור (Backfill) את צינורית המיקרו-מזרק (ראה חומרים), את המזרק ואת מחט הזכוכית המשוכה בשמן מינרלי בהתאם להוראות היצרן.

3. הכנת נקבות יתושים לקראת איסוף המוציטים

  1. שאבו 15 נקבות בוגרות לתוך כלי כלוב קטנים ומוצקים שניתן להביאם במגע עם קרח. טבלו את הכלוב עם היתושים בקרח בעומק מספיק כדי שכל גובה הכלוב וכל צדדיו יהיו במגע עם הקרח. פעולה זו תבטיח שכל היתושים ייחשפו לקור.
    הרדימו את היתושים באמצעות קור למשך כ-8 דקות או עד שלא יהיו ניידים יותר.
  2. הניחו יתוש אחד על תית קעור (depression slide). תית זה ישמש כאתר להזרקות.

4. איסוף המוציטים

  1. כוון את המיקרו-מזרק לשאיבת 12 μl של מדלול המולימף לתוך מחט זכוכית משוכה, והזרק את התמיסה לתוך היתוש בין מקטעי הבטן השביעי והשמיני. ניתן להזריק לכ-3 יתושים כ-3-3.5 μl מתוך נפח של 12 μl שנשאב. יש להחזיק את היתוש בעדינות במקומו בעזרת פינצטה בזמן ביצוע ההזרקה. נפח קטן של מדלול צריך להישאר בקצה המחט כדי למנוע הזרקה של שמן מינרלי. לאחר ההזרקה, הבטן צריכה להיראות "מלאה" או נפוחה.
  2. הנח את היתושים המוזרקים במיכל נקי ונפרד על קרח להתאוששות למשך 5 דקות. הדגירה של תמיסת המדלול נוגדת הקרישה בתוך היתוש תסייע לשחרר המוציטים הדבקים לרקמות פנימיות. בממוצע, ניתן להזריק ל-3 עד 5 יתושים טריים במהלך כל תקופת התאוששות של 5 דקות.
  3. לאחר 5 דקות של התאוששות, גזור את הרגליים, הכנפיים ואת קצה הבטן (במקטע השמיני) של כל יתוש בנפרד בעזרת מיקרו-מספריים. יש לבצע זאת בתוך כוס ההתאוששות המונחת על קרח. גזירת הרגליים והכנפיים מפחיתה את הסבירות להעברת קשקשים לעלויות האיסוף. הערה: אין לגזור את הרגליים והכנפיים קרוב מדי לאתרי החיבור לחזה, שמא תיווצרו פתחים נוספים לבריחת המולימף. יש לאסוף את המולימף אך ורק דרך הפתח שנוצר בקצה הבטן.
  4. שטוף עלית מיקרוסקופ מזכוכית עם חריטה ב-70% Ethanol וייבש אותה בעזרת Kimwipe. מקם יתוש אחד מוזרק ושהתאושש על העליה, על הקצה החיצוני של העיגול החרוט. כוון את המיקרו-מזרק לשאיבת 12 μl של מדלול המולימף טרי, והזרק נפח זה לתוך היתוש בצדו הלטרלי של המזו-חזה (mesothorax). הזרק את רוב נפח המדלול אך לא את כולו (כ-8–10 μl) כדי למנוע הזרקה של שמן מינרלי. נפח קטן של מדלול צריך להישאר בקצה המחט.
  5. מקם את היתוש כך שהפתח הגזור בבטן נמצא בקצה העיגול של 1 cm. לאחר ההזרקה, יש לאסוף את המולימף המדולל בתוך השטח המסומן. לאחר הוצאת המחט מאתר ההזרקה במזו-חזה, החזר את היתוש לאחיזה בין שתי זרועות הפינצטה ולחץ בעדינות על הבטן בעזרת הפינצטה כדי לכוון את המולימף אל אזור העיגול החרוט.
  6. הנח למולימף המדולל להתייבש על העליה למשך כ-10 דקות או עד שיהיה יבש באופן נראה לעין.

5. קיבוע וצביעה של המוציטים

  1. צבע כל סלייד בנפרד באמצעות HEMA3 7 (ראה חומרים): טבול את הסלייד במקבע 5 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם; טבול את הסלייד בתמיסה I 3 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם; ולבסוף, טבול את הסלייד בתמיסה II 3 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם. שטוף את גב הסלייד במים מזוקקים (DI water). אין לשטוף את חזית הסלייד. ייבש בעדינות באמצעות נייר סופג את חזית הסלייד מחוץ למעגל החרוט המכיל את הרקמה הצבועה.
  2. מרח מדיום עיגון (למשל Shur/Mount או Polymount) מסביב למרכז החרוט והנח עליו זכוכית כיסוי. לחץ קלות על זכוכית הכיסוי (25 x 25 mm) כך שמדיום העיגון יתפשט על פני כל השטח המכוסה על ידי זכוכית הכיסוי (כולל המעגל החרוט המכיל את הרקמה הצבועה). השאר את הסליידים לייבוש למשך 3 שעות לפחות או למשך הלילה. להשגת ויזואליזציה ודימוי אופטימליים, יש לבחון את ההמוציטים תוך שבועיים ממועד האיסוף.

6. תוצאות מייצגות

דוגמאות של המוציטים מקובעים וצבועים ב-HEMA3 שנאספו מנקבה בוגרת של Aedes aegypti מוצגות באיור 1A-C. איור 1A מראה המוציט שזוהה כפרוהמוציט (prohemocyte) על בסיס גודלו הקטן, צורתו הכדורית-ספרואידית ויחס הגרעין לציטופלזמה הגבוה (הגדלה של 550x) 11. איור 1B מראה המוציט שסווג כאואנוציטואיד (oenocytoid) על בסיס צורתו הספרואידית ויחס הציטופלזמה לגרעין הגבוה (הגדלה של 550x). לבסוף, איור 1C מראה המוציט מסוג גרנולוציט (granulocyte) (הגדלה של 550x). גרנולוציטים הם בעלי אופי גרנולרי יותר ונוטים להיות אמבואידיים יותר בצורתם ובהתנהגותם בעת היצמדותם למשטחי זכוכית. תוך שימוש בקריטריונים שפורסמו בעבר לסיווג והשגת המוציטים 11, שיטת האיסוף שלנו הניבה מספר דומה של המוציטים כוללים, ומצאנו באופן דומה כי גרנולוציטים מהווים את האחוז הגבוה ביותר מכלל ההמוציטים 11 (איור 2).

figure-protocol-1
איור 1. תמונות במיקרוסקופ אור של פרוהמוציט (A), אונוציטואיד (B) וגרנולוציט (C) מייצגים מקובעי HEMA3 וצבועים, מנקבת בוגרת של Ae. aegypti. C = ציטופלזמה, N = גרעין, G = גרנולות.

figure-protocol-2
איור 2. ספירה כוללת ± SE של כל ההמוציטים והגרנולוציטים שהושגו לכל נקבת יתוש באמצעות שיטת דילול ואיסוף ההמולימפה שלנו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שיטת איסוף hemocyte המתואר כאן הוא שונה משיטות שפורסמו בעבר ומאפשר לבודד את ההכנות נקי של hemocytes מ Aedes יתושים בצעדים פחות. בעוד עניין מיוחד שלנו טמון באפיון האוכלוסיות hemocyte ב Aedes יתושים, אנו מאמינים כי הטכניקה הזו יכול להיות מיושם על קבוצות אחרות יתוש לאחר הניסויים הראשוניים נערכים כדי לקבוע כרכים זריקה נכונה. פרוטוקול שלנו משתמשת מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח והתשואות אוכלוסייה של hemocytes זה משקף במדויק את המספרים in vivo. עם זאת, אנו לא נקב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תודות

המחברים מבקשים להודות ג'ון פריי ובן פיטרסון לגידול יתושים. אנו מודים גם כריסטין דייוויס גארי רדיס לעזרה עם micrographs hemocyte. מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת ריצ'מונד אומנויות & המילגה המדע הקיץ AA Qayum ואנשי סגל להעניק א טלנג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי הערות (אופציונלי)
שניידר בינוני סיגמא אולדריץ S0146
בסרום שור עוברית סיגמא אולדריץ F0643
Hema3 כתם ערכת דיג 123-869
זכוכית מחטים
(בורוסיליקט עם נימה) 		סאטר Instrument BF100-78-10 1.0mm OD ו - ID 0.78mm
מחט חולץ סאטר מכשירים דגם P-87
MicroInjector Tritech מחקר MINJ-PD
בעל מחט Tritech מחקר MINJ-4

מקורות

  1. Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
  2. Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
  3. Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
  4. Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
  5. Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
  6. Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
  7. Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
  8. Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
  9. Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
  10. Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
  11. Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים