שיטה פשוטה אך מדויקת לאסוף כתם hemocytes יתוש מתואר. השיטה שלנו משלבת את הפשטות של זלוף עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד את ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים. שיטה זו מקלה על מחקרים וידע המחייב של סוגי hemocytes ושפע שלהם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti
במאמר זה
סיכום
תקציר
יתושים הם וקטורים עבור מספר גורמי מחלות ומזיקים כגון וירוס קדחת צהובה, טפילי מלריה ותולעים filarial. מעבדות חוקרת אנטי הפתוגן מרכיבים של מערכת החיסון המולדת של וקטור מחלת מין בתקווה ליצור יתושים מהונדס, כי הם מגיבים פתוגנים כגון 1, 2. מערכת החיסון המולדת של יתושים כולל כמה שורות של הגנה 3. פתוגנים שמצליחים לברוח המכשול שהוטלו על ידי יתוש אפיתל מצופה midgut 4 להיכנס hemolymph והמפגש hemocytes במחזור, מרכיבים תאיים חשובים לתמצת פתוגנים לבלוע 5, 6. החוקרים לא מצאו ראיות רקמות hematopoietic ב יתושים ראיות הנוכחי עולה כי מספר hemocytes קבוע על הופעתה מבוגרים המספרים בפועל עשוי לרדת כפי הגילאים יתושים 7. היכולת לזהות כראוי לאסוף hemocytes מפני חרקים חשוב מבחינה רפואית היא צעד חיוני ללימודי חסינות הסלולר. עם זאת, גודלו הקטן של יתושים נפח מוגבל של hemolymph מהווים אתגר לאיסוף תאים חיסוניים.
שתי שיטות לאיסוף הוקמה hemocytes יתושים כולל גירוש hemolymph מתוך חוטם לחתוך 8, ועקירה נפח (זלוף), שבו מלוחים מוזרק באזור necklike קרומי בין הראש לבין החזה (כלומר, צוואר הרחם) לבין hemolymph perfused נאסף מפתיחת קרוע באזור הדיסטלי של הבטן 9, 10. טכניקות אלו, לעומת זאת, מוגבלים על ידי התאוששות נמוכה של hemocytes וזיהום אפשרי על ידי תאים שומן בגוף, בהתאמה 11. לאחרונה שיטה המכונה התאוששות הזרקה / התאוששות גבוהה משופרת של immunocytes על ידי שימוש מאגרים קרישה תוך הפחתת רמות זיהום קשקשים ורקמות פנימיות 11. אמנם שיטה המאפשרת שיטה משופרת של איסוף ושמירה hemocytes לתרבות העיקרי, הוא טומן בחובו מספר שלבים הזרקה איסוף שאינם נחוצים אם המטרה היא לאסוף את הזרם, לתקן כתם hemocytes עבור אבחון. הנה, אנחנו מדגימים את השיטה שלנו של איסוף hemolymph יתוש המשלבת את הפשטות של זלוף, באמצעות מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח, עם דיוק של טכניקות ההזרקה גבוה לבודד ההכנות נקי של hemocytes ב Aedes יתושים.
פרוטוקול
1. הכנה מוקדמת לאיסוף המוציטים
- הכינו תמיסת דילול להמולימף המורכבת מ-60% Schneider's Medium, 10% סרום עגל עוברי (FBS), ו-30% בופר ציטראט (נוגד קרישה; 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1.7 mM EDTA, 41 mM חומצה ציטרית, pH 4.5). 11הכינו מנות (aliquots) של 1.0 מ"ל שניתן לאחסן ב-20°Cהשתמשו בכל אליקוט פעם אחת בלבד (ראו חומרים).
- הכינו זכוכיות מיקרוסקופ (75 x 25 x 1 מ"מ) על ידי חריצת מעגל בקוטר 1 ס"מ בקצה אחד באמצעות כלי לחריטת זכוכית. לחלופין, ניתן לרכוש זכוכיות מיקרוסקופ עם שני מעגלים חרוטים מראש (לדוגמה, ממקורות של Fisher Scientific או EMS). יידרש זכוכית אחת עבור כל יתוש.
- הכינו סט של מחטי זכוכית (ראו חומרים) שנמשכו בהתאם להגדרות המוצעות הבאות (Sutter Instruments, דגם P-87):
עליית טמפרטורה מדורגת +5 משיכה: 45 מהירות: 75 זמן: 175 לחץ 580
תוך שימוש בהגדרות המוצעות במותח זה, אנו מייצרים מחטים באורך כולל של כ-500 מיקרון, עם אורכי גבעול של כ-3 מיקרון. ניתן לרכוש גם מחטים שנמתחו מראש (למשל, מ-Tritech Research).
2. הכנת המיקרו-מזרק לפני איסוף ההמוציטים
- הכנס מחט שנמשכה למחזיק המחט של המיקרו-אינז'קטור בהתאם להוראות היצרן. בצע מילוי אחורי (Backfill) של צינורית המיקרו-אינז'קטור (ראו חומרים), המזרק והמחט מזכוכית שנמשכה בשמן מינרלי בהתאם להוראות היצרן.
3. הכנת נקבות יתושים לפני איסוף המוסיטים
- שאיפו 15 נקבות בוגרות לתוך מיכלי כלובים קטנים ומוצקים שניתן להבאיים במגע עם קרח. טבלו את הכלוב עם היתושים בקרח לעומק מספיק כדי שכל גובה הכלוב וכל צדדיו יהיו במגע עם הקרח. פעולה זו תבטיח שכל היתושים ייחשפו לקור.
בצעו הרדמה בקור ליתושים למשך כ-8 דקות או עד שלא יהיו ניידים יותר. - הניחו יתוש אחד על תבנית זכוכית עם שקע (depression slide). תבנית זו תשמש כאתר להזרקות.
4. איסוף המוציטים
- כוון את המיקרו-מזרק לשאיבת 12 μl של מדולל המולימפה אל תוך מחט זכוכית משוכה, והזרק את התמיסה לתוך היתוש בין מקטעי הבטן השביעי והשמיני. ניתן להזריק לכ-3 יתושים נפח של 3-3.5 μl מתוך סך 12 μl הנפח שנשאב. יש להחזיק את היתוש בעדינות במקומו באמצעות פינצטה בזמן ביצוע ההזרקה. נפח קטן של מדולל צריך להישאר בקצה המחט כדי למנוע הזרקה של שמן מינרלי. לאחר ההזרקה, הבטן צריכה להיראות "מלאה" או נפוחה.
- הנח את היתושים המוזרקים במיכל נקי נפרד על קרח להתאוששות למשך 5 דקות. הדגירה של תמיסת המדולל נוגדת הקרישה בתוך היתוש תסייע בניתוק המוציטים (hemocytes) הדבקים לרקמות פנימיות. בממוצע, ניתן להזריק ל-3 עד 5 יתושים טריים במהלך כל תקופת התאוששות של 5 דקות.
- לאחר 5 דקות של התאוששות, גזור את הרגליים, הכנפיים ואת קצה הבטן (במקטע השמיני) של כל יתוש בנפרד באמצעות מיקרו-מספריים. פעולה זו צריכה להתבצע בכוס ההתאוששות המונחת על קרח. גזירת הרגליים והכנפיים מפחיתה את הסבירות להעברת קשקשים ללשוניות האיסוף. הערה: אין לגזור את הרגליים והכנפיים קרוב מדי לאתרי החיבור לחזה, כדי למנוע יצירת פתחים נוספים ממם עלולה לדלוף המולימפה. יש לאסוף את ההמולימפה רק דרך הפתח שנוצר בקצה הבטן.
- שטוף לשונית מיקרוסקופ אחת עם חריטה בזכוכית ב-70% Ethanol וייבש אותה בעזרת kimwipe. מקם יתוש אחד מוזרק ומותאושש על הלשונית, על הקצה החיצוני של המעגל החרוט. כוון את המיקרו-מזרק לשאיבת 12 μl של מדולל המולימפה טרי, והזרק נפח זה לתוך היתוש בצדו הלטראלי של המזוטורקס (mesothorax). הזרק את רוב נפח המדולל אך לא את כולו (כ-8 – 10 μl) כדי למנוע הזרקה של שמן מינרלי. נפח קטן של מדולל צריך להישאר בקצה המחט.
- מקם את היתוש כך שפתח הבטן הגזור נמצא בקצה המעגל של 1 cm. לאחר ההזרקה, יש לאסוף את ההמולימפה המדוללת בתוך השטח המסומן. לאחר הוצאת המחט מאתר ההזרקה במזוטורקס, המשך להחזיק את היתוש בין שתי זרועות הפינצטה ולחץ בעדינות על הבטן באמצעות הפינצטה כדי לכוון את ההמולימפה אל אזור המעגל החרוט.
- השאר את ההמולימפה המדוללת להתייבש על הלשונית למשך כ-10 דקות או עד שהיא יבשה באופן נראה לעין.
5. קיבוע וצביעה של המוציטים
- צבע כל סלייד בנפרד באמצעות HEMA3 7 (ראה חומרים): טבול את הסלייד במקבע 5 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם; טבול את הסלייד בתמיסה I 3 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם; ולבסוף, טבול את הסלייד בתמיסה II 3 פעמים למשך שנייה אחת בכל פעם. שטוף את גב הסלייד במים מזוקקים (DI water). אין לשטוף את חזית הסלייד. ייבש בטביטות את חזית הסלייד מחוץ למעגל החרוט המכיל את הרקמה הצבועה.
- מרח חומר הרכבה (לדוגמה Shur/Mount או Polymount) מסביב למרכז החרוט והנח עליו זכוכית כיסוי. לחץ בעדינות על זכוכית הכיסוי (25 x 25 mm) כך שחומר ההרכבה יתפשט על כל השטח המכוסה על ידי זכוכית הכיסוי (כולל המעגל החרוט המכיל את הרקמה הצבועה). השאר את הסליידים לייבוש למשך 3 שעות לפחות או למשך הלילה. יש לבחון את ההמוציטים תוך שבועיים ממועד האיסוף להשגת ויזואליזציה ודימוי אופטימליים.
6. תוצאות מייצגות
דוגמאות של המוציטים מקובעים וצבועים ב-HEMA3 שנאספו מנקבת בוגרת של Aedes aegypti מוצגות באיור 1A-C. איור 1A מראה המוציט שזיהינו כפרוהמוציט (prohemocyte) בהתבסס על גודלו הקטן, צורתו הכדורית-ספרואידית ויחס הגרעין לציטופלזמה הגבוה (הגדלה של 550x) 11. איור 1B מראה המוציט שסווג כאונוציטואיד (oenocytoid) בהתבסס על צורתו הספרואידית ויחס הציטופלזמה לגרעין הגבוה (הגדלה של 550x). לבסוף, איור 1C מראה המוציט מסוג גרנולוציט (granulocyte) (הגדלה של 550x). גרנולוציטים הם גרנולריים יותר מטבעם ונוטים להיות אמבואידיים יותר בצורתם ובהתנהגותם כאשר הם נצמדים למשטחי זכוכית. תוך שימוש בקריטריונים שפורסמו בעבר לסיווג והשגת המוציטים 11, שיטת האיסוף שלנו הניבה מספר דומה של המוציטים סה"כ, ומצאנו באופן דומה כי הגרנולוציטים מהווים את האחוז הגבוה ביותר מכלל ההמוציטים 11 (איור 2).
איור 1. תמונות במיקרוסקופ אור של פרוהמוציט (A), אונוציטואיד (B) וגרנולוציט (C) מייצגים מקובעים וצבועים ב-HEMA3 מנקבת בוגרת של Ae. aegypti. C = ציטופלזמה, N = גרעין, G = גרנולות.
איור 2. ספירה כוללת ± SE של כל ההמוציטים והגרנולוציטים שהתקבלו מיתושה נקבה באמצעות שיטת דילול ואיסוף ההמולימפה שלנו.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת איסוף hemocyte המתואר כאן הוא שונה משיטות שפורסמו בעבר ומאפשר לבודד את ההכנות נקי של hemocytes מ Aedes יתושים בצעדים פחות. בעוד עניין מיוחד שלנו טמון באפיון האוכלוסיות hemocyte ב Aedes יתושים, אנו מאמינים כי הטכניקה הזו יכול להיות מיושם על קבוצות אחרות יתוש לאחר הניסויים הראשוניים נערכים כדי לקבוע כרכים זריקה נכונה. פרוטוקול שלנו משתמשת מאגרים קרישה במקום תמיסת מלח והתשואות אוכלוסייה של hemocytes זה משקף במדויק את המספרים in vivo. עם זאת, אנו לא נקב...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
המחברים מבקשים להודות ג'ון פריי ובן פיטרסון לגידול יתושים. אנו מודים גם כריסטין דייוויס גארי רדיס לעזרה עם micrographs hemocyte. מחקר זה מומן על ידי אוניברסיטת ריצ'מונד אומנויות & המילגה המדע הקיץ AA Qayum ואנשי סגל להעניק א טלנג.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| שניידר בינוני | סיגמא אולדריץ | S0146 | |
| בסרום שור עוברית | סיגמא אולדריץ | F0643 | |
| Hema3 כתם ערכת | דיג | 123-869 | |
| זכוכית מחטים (בורוסיליקט עם נימה) | סאטר Instrument | BF100-78-10 | 1.0mm OD ו - ID 0.78mm |
| מחט חולץ | סאטר מכשירים | דגם P-87 | |
| MicroInjector | Tritech מחקר | MINJ-PD | |
| בעל מחט | Tritech מחקר | MINJ-4 |
מקורות
- Enayati, A., Hemingway, J. Malaria management: past, present, and future. Annu. Rev. Entomol. 55, 569-569 (2010).
- Medlock, J., Luz, P. M., Struchiner, C. J., Galvani, A. P. The impact of transgenic mosquitoes on dengue virulence to humans and mosquitoes. The American Naturalist. 174, 565-565 (2009).
- Baton, L. A., Garver, L., Xi, Z., Dimopoulos, G. Functional genomics studies on the innate immunity of disease vectors. Insect Sci. 15, 15-15 (2008).
- Thomas, R. E., Wu, W. K., Verleye, D., Rai, K. S. Midgut basal lamina thickness and dengue-1 virus dissemination rates in laboratory strains of Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J. Med. Entomol. 30, 326-326 (1993).
- Bartholomay, L. C. Profiling infection responses in the haemocytes of the mosquito, Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 16, 761-761 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15, 1-1 (2008).
- Hillyer, J. F. Age-associated mortality in immune challenged mosquitoes (Aedes aegypti) correlates with a decrease in haemocyte numbers. Cell. Microbiol. 7, 39-39 (2005).
- Chen, C. C., Laurence, B. R. In vitro study on humoral encapsulation of microfilariae: establishment of technique and description of reaction. International Journal for Parasitology. 17, 781-781 (1987).
- Beerntsen, B. T., Christensen, B. M. Dirofilaria immitis: effects on hemolymph polypeptide synthesis in Aedes aegypti during melanotic encapsulation reactions against Microfilariae. Exp. Parasitol. 71, 406-406 (1990).
- Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. The antibacterial innate immune response by the mosquito Aedes aegypti is mediated by hemocytes and independent of Gram type and pathogenicity. Microb. Infect. 6, 448-448 (2004).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36, 891-891 (2006).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
