מחקרים עדכניים רבים זיהו מוטציות חלבונים סינפטיים הקשורים פתולוגיות במוח. ראשי נוירונים בקליפת המוח בתרבית להציע גמישות רבה לבחון את ההשפעות של מחלות אלה הקשורים חלבונים על מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה הדנדריטים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח של מורפולוגיה השדרה דנדריטים של נוירונים במערכת העצבים המרכזית Cultured
במאמר זה
סיכום
תקציר
הקוצים הדנדריטים הם האתרים של רוב הקשרים מעוררים בתוך המוח, ויוצרים את תא פוסט סינפטי של סינפסות. מבנים אלו עשירים אקטין הוכח להיות מאוד דינמי. בתגובה פלסטיות Hebbian הקלאסית כמו גם אותות neuromodulatory, הקוצים הדנדריטים יכולים לשנות את הצורה ואת מספר, אשר נחשב קריטי עבור עידון של מעגלים עצביים ועל עיבוד ואחסון של מידע בתוך המוח. בתוך הקוצים הדנדריטים, רשת מורכבת של חלבונים הקישור אותות תאיים עם cyctoskeleton אקטין המאפשר שליטה על מורפולוגיה עמוד השדרה במספר הדנדריטים. מחקרים Neuropathological הוכיחו כי מספר מדינות המחלה, החל סכיזופרניה הפרעות הספקטרום האוטיסטי, להציג עמוד השדרה נורמלי מורפולוגיה הדנדריטים או מספרים. יתר על כן, מחקרים גנטיים האחרונות זיהו מוטציות בגנים המקודדים חלבונים רבים הסינפטי, המוביל הצעות כי חלבונים אלה עשויים לתרום גמישות עמוד השדרה סוטה כי, בין השאר, בבסיס הפתופיזיולוגיה של הפרעות אלה. על מנת ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של חלבונים אלה בשליטה מורפולוגיות עמוד השדרה הדנדריטים / מספר, השימוש של נוירונים בקליפת המוח בתרבית מציע מספר יתרונות. ראשית, מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של הקוצים הדנדריטים בתאים קבועים, כמו גם זמן לשגות הדמיה של תאים חיים. שנית, זו מערכת חוץ גופית מאפשר מניפולציה קלה של תפקוד החלבון על ידי ביטוי של חלבונים מוטנטים, מציאה על ידי בונה shRNA, או טיפולים תרופתיים. טכניקות אלו מאפשרים לחוקרים להתחיל לנתח את התפקיד של מחלות הקשורות חלבונים לחזות כיצד מוטציות של חלבונים אלה יפעלו in vivo.
פרוטוקול
הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להשתמש כדי לבחון מורפולוגיה עמוד השדרה הדנדריטים ודינמיקה בכל מערכת תרבותית ראשונית.
1. הכנת העיקרי בתרבויות נוירונים בקליפת המוח
- הכן בצפיפות גבוהה תרבויות נוירון קורטיקלי מ Sprague-E18 Dawley עוברי חולדה ותרבות בינוני סרום ללא גליה ממוזג 1-2.
- להרדים עכברוש אחד בהריון (E18) על פי הנהלים ACUC; במהירות להסרת הרחם (עם עוברים את זה) ומניחים בצלחת פטרי 100 מ"מ על הקרח.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הטכניקות המתוארות לעיל עבור ניתוח כמותי מפורט של עמוד השדרה הדנדריטים מורפולוגיה, תנועתיות צפיפות לינארית בשני הנוירונים קבוע או לחיות קליפת המוח העיקריים הם התמקדו בהבנת ההשפעות של הפוסט סינפטי מנגנונים עשויים לתרום neuropathologies. גישה דומה ניתן לכמת מורפולוגיה תנועתיות עמוד השדרה או על כל נוירון קוצני, כולל פירמידה בהיפוקמפוס, פורקינג', או נוירונים קוצני בינוני.
הפרוטוקול המתואר כאן ניתן להתאים מסתכל על .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
הפקה של עבודה זו נתמכה על ידי MetaMorph (התקנים מולקולריים, Inc).
תודות
אנו מודים קלי ג'ונס לעריכה זהיר. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק R01MH 071,316, האגודה לאלצהיימר, הברית הלאומית למחקר על סכיזופרניה ודיכאון (NARSAD), והברית הלאומית לחקר האוטיזם (NAAR) (PP); American Heart Association אחוות דוקטורים (DPS); האמריקאי איגוד הלב אחוות Predoctoral (KMW).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| 18 מ"מ מכסה זכוכית עגול מס '1.5 | וורנר מכשירים | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 מ"מ מרובע כיסוי זכוכית מס '1.5 | וורנר מכשירים | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-ליזין | סיגמא | P-0899 | MW 70 ~ 150 KDA |
| Neurobasal מדיה | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| גלוטמין | Invitrogen | 21051024 | |
| פניצילין, סטרפטומיצין | Invitrogen | 15140148 | |
| D, L-APV (AP-5) | אסנט מדעי | ASC-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech Cellgro | 25-060 C-1 | 1M, pH 7 |
| פורמלדהיד פתרון | EMD כימיקלים | FX0415-5 | 36%, היסטולוגיה כיתה |
| עזים רגיל סרום | VWR | 100188-514 | ג'קסון Immunoresearch Labs |
| טריטון X-100 | פישר סיינטיפיק | AC21568-2500 | Acros אורגניקס |
| אלקסה פלואוריד 488 אנטי עכבר עז IgG (H + L) מאוד צולבות adsorbed | Invitrogen | A-11029 | |
| אלקסה פלואוריד 488 עיזים נגד ארנב IgG (H + L) * מאוד * צולבות adsorbed | Invitrogen | A-11034 | |
| להאריך מגיב antifade זהב | Invitrogen | P36934 | אריזות מיוחדות |
| הדמיה למכתב הבמה קאמרית | וורנר | RC-30HV | |
| בקר טמפרטורה יחידה | וורנר | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
מקורות
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
