חסכונית שיטת מעקב אחר מקור מיקרוביאלית באמצעות וירוסים אדם ובעלי חיים ספציפיים

Summary

המחקר מתאר שיטה חסכונית לזיהוי מקור הזיהום צואה / שתן או זיהום חנקות במים באמצעות כימות qPCR עבור הספציפי של נגיפי DNA, adenoviruses אדם / חזירי / שור ו polyomaviruses, כפי שהוצע כלים MST.

Abstract

זיהום מיקרוביאלית של הסביבה מהווה סיכון בריאותי משמעותי. קלאסי אינדיקטורים צואתי חיידקי הראו שיש מגבלות משמעותיות, וירוסים הם עמידים יותר בפני תהליכי איון הרבה אינדיקטורים צואה רגילה לא להודיע ​​על מקור הזיהום. פיתוח חסכונית שיטות ריכוז של וירוסים ממים מבחני מולקולרית מקלה את הישימות של וירוסים כאינדיקטורים לזיהום צואתי ו חיידקים כמו מעקב אחר המקור (MST) כלים. Adenoviruses ו polyomaviruses הם נגיפי DNA מדביק בעלי החוליות כולל בני אדם ספציפיים, ומופרשים בצואה בהתמדה ו / או שתן בכל האזורים הגיאוגרפיים למד. במחקרים קודמים, הצענו כימות adenoviruses האנושי (HAdV) ו polyomaviruses JC (JCPyV) על ידי ה-PCR כמותי (qPCR) כאינדקס של זיהום צואתי אנושי. לאחרונה, פיתחנו מבחני qPCR עבור כימות מסוים של porcine adenoviruses (PAdV) ו polyomaviruses שור (BPyV) כסמנים של זיהום צואתי חיה עם רגישויות של עותקים בגנום 1-10 לכל מבחנה. במחקר זה, אנו מציגים את והנוהל לזהות את מקור הזיהום בדגימות מים באמצעות כלים אלה. כדוגמה נציג של תוצאות, ניתוח של וירוסים במים הקרקע הצגת רמות גבוהות של חנקות מוצג.

איתור של וירוסים במים מזוהמים נמוך או בינוני דורש ריכוז של וירוסים מ לפחות כמה ליטרים של מים לתוך נפח קטן בהרבה, הליך שבדרך כלל כולל שני שלבים ריכוז בסדרה. זו פרוצדורה מסורבלת במקצת ואת השתנות נצפתה החלמה ויראלי משמעותי בסל עיבוד בו זמני של מספר גדול של דגימות המים.

על מנת למנוע את צוואר הבקבוק נגרמת על ידי שני שלבים נהלים יישמנו פרוטוקול צעד אחד שפותח studie הקודםs ו החלים על מגוון של מטריצות מים. ההליך כולל: החמצה של עשרה ליטר דגימות מים, הפתתה על ידי חלב דל שומן, שקיעה הכובד של חומרי flocculated, אוסף של המשקע ו צנטריפוגה, resuspension של המשקע במאגר פוספט 10 מ"ל. להתרכז ויראלי משמש להפקת חומצות גרעין ויראליות ואת adenoviruses ספציפיים polyomaviruses של הריבית על ידי לכמת qPCR. מספר גבוה של דגימות עשוי להיות מנותח בו זמנית בשיטה זו עלות נמוכה ריכוז.

הנוהל הוחל על ניתוח של מי ים, מי ים ומים הנהר במחקר זה, אנו מציגים תוצאות ניתוח דגימות מי התהום. שיטה זו תפוקה גבוהה כמותי אמין, פשוט, וחסכוני.

Protocol

1. ריכוז של חלקיקים נגיפיים נוכח דגימות מים

1. אוסף ומיזוג של דגימות מים
   1. איסוף מינימום של 2 משכפל של L 10 לדגימה במכלי פלסטיק עם תחתית שטוחה דגימה אחת נוספת כמו בקרת תהליך. מדגם זה האחרון יהיה ממוסמר עם כמות ידועה של חלקיקים נגיפיים לשמש מלאה.
      הערה: מומלץ יש חומר מיוחד נפרד (בקבוקים, צינור וכו ') עבור דגימות ממוסמר.
   2. בדיקת כיול של conductimeter ו לכייל מחדש במידת הצורך. הכן בקרה שלילית על ידי שימוש במ....

Discussion

ההליך המתואר היו מקיימים את התנאים של שיטה מתאים שגרתי במעבדות בריאות הסביבה והציבור: לשחזור, אמינה, פשוטה וחסכונית. פרוטוקול היא פשוטה, אך היא חייבת להיות מלווה בזהירות. מוליכות נמוכה בדגימות מבלי להוסיף את הריכוז המבוקש של מלחי ים מלאכותי יהיה להפחית באופן דרמטי את ההתאוששות של וירוסים גם יהיה המקרה אם הזמן ערבוב הפתתה מצטמצם משמעותית (פחות מ 5 שעות, למשל).

מיושם כיום כלים MST מתבססים בדרך כלל על שיטות מו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
צנטריפוגות מהירות גבוהה (8000 XG)	Berckman קולטר	אוואנטי J-20XP
ה-pH מטר, מדחום conductimeter	Afora	LPPC3003
צינורות פלסטיק 100-200 ס"מ אורך	Deltalab	350059
סטרילי סיים pipettes הפנויה	Labclinics	PN10E1
צינורות פלסטיק סטרילית של 1.5 מ"ל ו - 10-15 (Eppendorf, פלקונס, וכו ')	Afora	KA298/00
צנטריפוגה סירים (500 מ"ל)	פישר סיינטיפיק	SE5753512
Stirrers מגנטיים מגנטים (אחד לכלהמדגם)	פישר סיינטיפיק	10510
מיכלי זכוכית או פלסטיק בעל תחתית שטוחה כדי לאפשר את השימוש stirrers מגנטי	Deltalab	191642
משאבה peristaltic להסרת supernatant (או משאבת מים סילון ואקום)	ווטסון, מרלו	323E / D
טיימר כיבוי כדי בחישה לאחר 8-10 שעות	Deltalab	900400
חומצה הידרוכלורית (1N ו 0.1N)	Panreac	141020.1611
סודיום הידרוקסיד (1N)	Panreac	131687.1211
מלאכותית ים מי ים ומלחים	סיגמא	S9883
חלב נטול שומן (SM)	Difco	232100
פוספט חיץ pH 7, 5			01:02 v / v סטרילית של Na 2 HPO 4 0,2 M ו לאא 2 PO 4 0,2 M ב-pH 7.5
Thiosulphate	Panreac	121879.1209	הפוך את פתרון 10% מים
QIAamp נגיפי RNA Mini Kit	Qiagen	52904
96, גם התגובה בצלחת אופטי (500 יחידות)	Applied Biosystems	43426659
מכסה דבק אופטי (100 יחידות)	Applied Biosystems	4311971
TaqMan הסביבה PCR מיקס מאסטר 2x	Applied Biosystems	4396838