פסיפס ניתוח פונקציה ג'ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre

סיכום

In vivo שיטת לבדוק תפקוד הגנים במוח לאחר הלידה מתוארת. AAVs רקומביננטי להביע Cre ו / או חלבון פלואורסצנטי מוזרקים במוח העכבר הילוד. גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה מושגות, דבר המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד הגן בתהליכים קריטיים לפיתוח מעגלים עצביים.

תקציר

תפקוד המוח רגיל נשענת לא רק על ההתפתחות העוברית כאשר מסלולים עצביים העיקריים מבוססים, אלא גם על התפתחות הלידה, כאשר מעגלים עצביים הם הבשילו ומעודן. Misregulation בשלב זה עשויה להוביל להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם ^1,2. גנים רבים נחקרו במוח טרום לידתי ומצא חיוני לתהליכים התפתחותיים רבים ^3-5. עם זאת, תפקידם במוח לאחר הלידה אינו ידוע ברובו, בין השאר משום המחיקה שלהם בעכברים מובילה לעיתים קרובות הקטלניות במהלך התפתחות הילוד, וגם מפני הדרישה שלהם בהתפתחות המוקדמת מעכבת את הניתוח לאחר הלידה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, floxed האללים של גנים אלה נמצאים בשלבי שנוצר בעכברים ^6. בשילוב עם אללים מהונדס המבטאים Cre recombinase ב סוגי תאים מסוימים, המחיקה מותנית יכולה להיות מושגת ללמוד לתפקד גנים במוח לאחר הלידה. עם זאת, שיטה זו דורשת אללים נוספים תוספת זמן (3-6 חודשים) על מנת ליצור את העכברים עם גנוטיפים המתאימים, וכך להגביל את הרחבת הניתוח גנטית בקנה מידה גדול במוח העכבר.

כאן אנו משלימים להפגין גישה המשתמשת Cre virally-הביעו ללמוד אלה אללים floxed במהירות ובאופן שיטתי בהתפתחות המוח לאחר הלידה. באמצעות הזרקת רקומביננטי adeno הקשורים וירוסים (rAAVs) ^7,8 קידוד Cre לתוך המוח בילוד, אנו מסוגלים למחוק את הגן של עניין באזורים שונים של המוח. על ידי שליטה על כייל ויראלי coexpressing סמן חלבון פלואורסצנטי, אנחנו יכולים להשיג בו זמנית גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה. שיטה זו עוקפת את הדרישה של גנים רבים בפיתוח מוקדם, מאפשר לנו ללמוד תפקוד התא האוטונומי שלהם תהליכים קריטיים רבים בהתפתחות המוח לאחר הלידה, כולל צמיחה axonal ו דנדריטים, מסתעפת, ו ריצוף, וכן היווצרות הסינפסה ועידון. שיטה זו שימש בהצלחה במעבדה שלנו (תוצאות לא פורסם) ואחרים ^8,9, ו - ניתן להרחיב וירוסים אחרים, כגון ⁹ lentivirus, כמו גם לביטוי של חלבונים או shRNA פעיל דומיננטי ^10. יתר על כן, על ידי שילוב של טכניקה זו עם electrophysiology וכן לאחרונה פיתחה כלי הדמיה אופטית ^11, שיטה זו מספקת אסטרטגיה חדשה ללמוד איך מסלולים גנטיים המשפיעים על התפתחות המעגל העצבי לתפקד וגם עכברים וחולדות.

פרוטוקול

1. וירוסים הכנה הזרקה

1. rAAVs נרכשו מהספק מסחרי מומלץ, אבל הם יכולים גם להיות מיוצר במעבדה של עצמו (ראה דיון בהמשך). הפתרון וירוס מופק בדרך כלל כייל של ~ 1x10 ¹² עותקים בגנום למיליליטר (GC / ml) וניתן להשתמש בו בכל titer מלא לתפעל מספר גדול של תאים. לחלופין, הם יכולים להיות מדולל כדי לייצר את הרמה הרצויה של תיוג דלילה. דילול המתאים צריכה להיקבע על ידי המשתמש, אלא דילול 1:10 מומלץ להתחיל.
2. הפשירי וירוסים על קרח מיד לפני השימוש. העברת הרצוי מראש דילול נפח פתרון וירוס לתוך קטן (~ 250μl) צינור PCR. לדלל את הפתרון וירוס באמצעות נפח המתאים DPBS סטרילי במנדף בתרבית רקמה. חנות פתרון וירוס בדילול מלא על הקרח עד שהוא צורך.

הערה: הטיפול של כל הווירוסים צריכה להתנהל על פי פרוטוקול שאושר על ידי המוסד biosafety שלך

2. מזרק טעינה והרכבה ציוד

1. חבר את מחט המזרק כדי טעינת זכוכית לגבש את הפתרון וירוס מהצינור PCR על ידי משיכתו בעדינות על הבוכנה. משוך את הבוכנה עד בועה קטנה מאוד של אוויר ניתן לראות את המזרק, זה מצביע על כך כל הפתרון הוא המזרק ולא נשאר מחט הטעינה. לחלופין, כמות קטנה של צבען אינרטי ניתן להוסיף את הפתרון כדי להפוך אותו לגלוי.
   הערה: שפופרת קטנה PCR צריך לשמש את המחט טוען הוא בדרך כלל לא מספיק זמן כדי להגיע לתחתית של צינורות אחרים ביותר.
2. הסר את המחט העמסה מקום את המזרק על לחסום את המזרק של משאבת מזרק, לקבע אותו עם משרת את המזרק.
3. הכנס בעדינות קצה אחד של צינור החיבור לתוך המזרק, להכניס את הקצה השני לתוך המחזק את המחט. הכנס את מחט הזריקה לתוך המחזק את המחט. סופו של מחט הזריקה צריך לפנות ישירות סוף בתוך צינורות החיבור של בעל מחט.
4. לאט לאט לוחץ על המתג ידנית לדחוף את הפתרון באמצעות צינור החיבור. Push עד טיפה פתרון נראה לעין בקצה מחט הזריקה.
5. בזהירות למיקום הבוכנה הבא כדי לחסום את דחפן ומאובטח אותו במקום עם סוגר את הבלוק הסמים.
6. הגדר את הפרמטרים הזרקה: קצב ההזרקה צריך להיות כ 8μl/min (~ 130nl / s); נפח הזרקה הוא בדרך כלל 1-2ul, בחר את קוטר מזרק מתאים לגודל המזרק אתה משתמש (ראה מזרק משאבה ידנית לקבלת הנחיות).
7. הגדר את פלטה חשמלית ל ~ 38 ° C ו מכסים במגבת נייר או מחסום דק אחרים כדי להגן על הגורים במהלך שלב ההחלמה.

3. הזרקת הליך והתאוששות גור

1. הכן P0 או P1 גורים עכבר להזרקה באמצעות חשיפתן הרדמה קר הבאה פרוטוקול שאושר IACUC. לחלח מגבות נייר עם מעט מים ומניחים על קרח. מניחים את המספר הרצוי של הגורים (4-5) על מגבת נייר (להשאיר אותם מופרדים היטב) בעדינות לקפל את מגבות נייר על הגורים אז הם מכוסים על ידי מגבת נייר לחה. בעדינות במקום כמות קטנה של קרח מרוסק על גבי מגבות נייר דגירה את הגורים למשך כ 5 דקות. הגורים יכולים להישמר על הקרח עד 15 דקות להתאושש יפה לאחר מכן.
2. אחרי הגור הוא הרדים מספיק, למקם אותו על בלוק הרכבה (אנו משתמשים בלוק קלקר שבדרך כלל מחזיקה 15 מ"ל צינורות) ומקם אותה הגישה הטובה ביותר הזריקה. עבור בקליפת היא הקלה ביותר כדי להניח את שטוח חיה על הבטן שלה, בעוד המוח הקטן כדאי למקם את ראשו של הגור מעבר לקצה הרחוב כדי לספק גישה טובה יותר האחורי של הגולגולת. הגור יכול להיות מאובטחת במקום עם פלסטר, אם תרצה בכך.
3. החזק את ראשו של הגור במקום ביד אחת בעוד המחט מוחדרת באופן ידני במקום הרצוי ביד השנייה דרך הגולגולת. זה עוזר למשוך את העור חזק כדי למנוע ממנה לזוז במהלך ההזרקה. עבור בקליפת כדאי להפוך את זריקות ביחס ציון דרך מוגדרת היטב אנטומיים, כמו תפר למבדה של הגולגולת, כמו זה יסייע זריקות בעתיד. המוח הקטן ניתן לראות דרך הגולגולת כמו רצועה דקה של רקמה שוכב הזנב ישירות colliculus. העומק שאליו את המחט צריך להיות מוכנס משתנה מעט בין החיות זנים בודדים תעיד על ידי סמנים מראש על המחט, אולם עבור קליפת המוח ואת המוח הקטן אנו מוצאים כי עומק של ~ 0.5 - 1mm מפני השטח מתאים בדרך כלל. עומק הכניסה לאתרים אחרים צריך להיקבע באופן ניסיוני על ידי משתמש הקצה.
   הערה: המחט צריכה לחדור בקלות את הגולגולת, ואם לא, לא לדחוף יותר מדי קשה כמו זה יכול לפגוע בבעלי חיים. שנה את מיקום המחט בעדינות לנסות שוב.
4. להזריק את הפתרון וירוס. הזריקה היא להתחילעורך ידי לחיצה על כפתור START על המשאבה או מדכא דוושת רגל, בהתאם לדגם של לחץ ההזרקה נעשה שימוש. בהעדר דוושת רגל מומלץ יש עמית לסייע עם לחיצה על כפתור כדי למזער תנועות ידיים מיותרות שעלולות להשפיע על הזריקה.
5. לאחר שנבחר נפח כבר הזריק, לשמור את המחט במקום במשך כמה שניות ואז בעדינות להסיר את המחט על ידי הזזה זה בצורה חלקה. הקפידו להחזיק את ראשו של הגור במקום כדי למזער תנועות מיותרות. מאחר ציוד הזרקה הוא ניקה מעוקרים בין ניסויים עם אתנול פצע קטן, השימוש חיטוי מיותר.
6. הנח את הגור על הכיריים מכוסה להגדיר את הטמפרטורה ~ 38 ° C כדי לחמם אותו להתאוששות, בדרך כלל 50-10 דקות. במהלך תקופה זו תוכל להמשיך הזרקת גורים אחרים.
7. אחרי כל הגורים התאוששו (הם צריכים להיות ורוד ונעים) לקחת חלק תשתית הביתה לשפשף בעדינות את הגורים עם זה. החזר את הגורים לאם כקבוצה.

הערה: חשוב מאוד לוודא הגורים חמים חשופים מצעים הביתה לפני החזרת אותם לאם להחזיר אותם כקבוצה. הימנעות מלעשות זאת עלולה לגרום אמו ופצע או הרג גורים.

4. ציוד ניקוי

1. לאחר הזריקה היא להשלים את הגורים הוחזרו אמם, לנקות את ההתקנה על ידי הזרקת מלא טעינת את המזרק עם אצטון או אתנול 70%. פלאש הפתרון דרך ההתקנה מספר פעמים הזרקה, באמצעות פתרון טריים בכל פעם. פעולה זו תסיר כל פתרון וירוס שנותרו משקעים. אצטון או אתנול אז יהיה להתאדות.
   הערה: אצטון הוא העדיף לניקוי, אבל אם ההגדרה שלך משתמש בכל אצטון רגיש רכיבים, כגון דבקים cyanoacrylate, ולאחר מכן להשתמש באתנול 70% עבור פעולות אלה.
2. לחטא את האזור עובד עם אקונומיקה ולסלק פסולת במיכל Biohazard המתאים.

5. אנליזה

1. הקורבן חיות בגיל הרצוי באמצעות שיטה IACUC אושרה המתת חסד. קיבעון זלוף מומלץ לסייע להדמיה מאוחר יותר של נוירונים נגוע, בעיקר אצל בעלי חיים מבוגרים.
2. נהלים immunostaining רגיל ניתן להשתמש כדי להגביר את האות ניאון. בקצרה, 100 מיקרומטר צף סעיפים vibratome הם permeabilized עם PBS 1% Triton X-100 ו - חסום PBS 1% Triton X-100 10% נסיוב עז נורמלי. מדורים מודגרת בחסימת פתרון עם נוגדנים העיקרי בין לילה ב 4 ° C, ואחריו נוסף כביסה חסימה. מדורים מודגרת אז חסימת פתרון עם נוגדנים משני 2 שעות בטמפרטורת החדר, לשטוף ביסודיות, רכוב על שקופיות coverslipped עם אנטי לדעוך התקשורת גובר. Cryosections ניתן להשתמש גם לדמיין שכותרתו נוירונים, לעומת זאת הקרינה אנדוגני עלול להיות אבוד.

6. נציג תוצאות:

הליך זריקה מוצלחת תייצר זיהום החזקה של נוירונים באזור ההזרקה ללא נזק לרקמות הנצפה או השפעות שליליות אחרות על החיה. כמו באיור 1, התפשטות הזיהום ניתן לצפות Cre-כתב עכברים (ROSA26R) ¹² מוזרק עם rAAV8-Cre באתרים אנטומיים שונים. זריקות לתוך אזורים ספציפיים, כגון קליפת המוח מעולה colliculus, בדרך כלל ליצור דלקות מקומיות עם התפשטות מינימלי לאזורים סמוכים (איור 1A-B). השימוש בפתרון כייל גבוה וירוס גורם לזיהום של אזורים סמוכים, כמו בהיפוקמפוס, סביר יותר (איור 1A). עם הזרקת וירוס כייל נמוך התוצאות פתרון לזיהום דלילה, אשר בדרך כלל נשארת ליד הזריקה, כפי שמוצג הזריקה cerebellar של rAAV8-Cre ב קו האמצע של עכברים ROSA26R הכתב (תרשים 1C-D). ראינו רקומבינציה בעכברים ROSA26R הכתב בתוך 2 ימים לאחר הזרקת rAAV8-Cre, דבר המצביע על כך, זיהום רקומבינציה, ואת הביטוי של גנים הכתב יכולים להתרחש מהר יחסית. בנוסף, השתמשנו בהצלחה בטכניקה זו כדי לחקור את ההשפעות של מחיקת הגן על מוקד בלתי ROSA באמצעות אלל מותנה floxed, התוצאות אשר יפורסמו במקומות אחרים.

מספר תאים נגועים צריך לתאם עם כייל הפתרון ויראלי מוזרק. לדוגמה, הזרקת תערובת של פתרונות כייל גבוה של שני rAAV8 וירוסים להביע חלבוני ניאון שונים לתוך המוח הקטן מדביק תאים רבים פורקינג' המוגדרים דיפרנציאלי (איור 2 א). לעומת זאת, הזרקת פתרון נמוך titer וירוס יכול לגרום זיהום דלילה לסייע חזותי תאים בודדים (איור 2B). נוירונים שכותרתו fluorescently ניתן לצפות ישירות טריים, רקמת חיים (איור 2B) או יכולה להיות נתונה immunostaining כדי לשפר את אותות ניאון אנדוגני לרכישת התמונה מאוחר יותר על ידי שדה רחב או שיתוףמיקרוסקופ פלואורסצנטי nfocal (איור 2A, איור. 3A-C). לבסוף, rAAV8 מסוגל להדביק מגוון של סוגי נוירונים בקליפת המוח עם תיוג חזק של תהליכים קנס (איור 3A-C).

איור 1: מכתים LacZ במוח של עכברים ROSA26R כתב כי הוזרקו rAAV8-Cre ב P0 מדגים פעילות Cre ואת המיקום של זיהום.

1. רחב בתחום לצפות sagittal של המוח P14 המראה כייל גבוה (1x10 ¹² GC / מ"ל) זריקות לתוך קליפת מעולה colliculus. השימוש וירוס כייל גבוה עושה את זה סביר יותר להניח כי באזורים הסמוכים יהיה גם נגועים.
2. סעיף sagittal של קליפת P14 מוזרק עם כייל נמוך (1x10 ¹¹ GC / מ"ל) מדגים וירוס דלקת מקומית עם פחות להתפשט.
3. השקפה wholemount של המוח הקטן P28 מוזרק על קו האמצע עם כייל נמוך (1x10 ⁹ GC / מ"ל) פתרון וירוס מראה כי הזיהום הוא דליל ובדרך כלל נשאר ליד הזריקה.
4. להציג sagittal של קו האמצע של המוחון ב-C). שים לב כי תאי פורקינג' רק בדרך כלל נגועים על ידי rAAV8.

איור 2: תיוג cerebellar בזריקה עם titers גבוה ונמוך של rAAV8 להביע חלבוני ניאון.

1. קטע sagittal של P21cerebellum נגוע עם שילוב של שני הנגיפים להביע EGFP (ירוק) ו DsRed (אדום). לערבב כייל גבוה של וירוסים שימש להדביק מספר גדול של תאים פורקינג'.
2. תא פורקינג' במוח הקטן P14 לחיות מזיהום כייל נמוך מאוד ויראלי צילמו מיד לאחר דיסקציה.

איור 3: תיוג קליפתיים ידי rAAV8-DsRed.
דוגמאות של מגוון סוגי נוירונים בקליפת המוח בסעיפים העטרה של קליפת p21 שהיה נגוע rAAV8 DsRed ב-P0.

דיון

השיטה בילוד הזרקת נגיפי המוצג כאן מספק דרך פשוטה ומהירה ליצור בפסיפסים vivo לחקר התפתחות המוח לאחר הלידה. השיטה מנצלת אללים floxed הזמינים כעת וכן אלה הנעשים דרך הגן תפוקה גבוהה מיקוד הפרויקט ^6. לעומת השימוש בביטוי מהונדס של Cre, שיטה זו מספקת דרך מהירה לבדוק את תפקוד הגנים סוגי תאים שונים, כמו עכברים שנשאו את אללים floxed ניתן להשתמש ישירות עבור ניסויים, ואת וירוס כל זריקה ההליך מתחילתו ועד סופו יכול להיות הושלמה בתוך פחות משעה. בנוסף, מספר תאים נגועים ניתן לש...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
rAAV8-Cre,-GFP,-DsRed,	וקטור Biolabs	# 7060, # 7061, סדר מותאם אישית	http://www.vectorbiolabs.com
הרווארד משאבה 11 פלוס	הרווארד Apparatus	# 702208	(אין יציאת דוושת רגל)
פיגמנט רשתית אפיתל הזרקת Kit	העולם מכשירי דיוק	הרשתית-KIT	מכיל חיבור, צינורות הזרקה ומחטים (36G), וכן בעל מחט
NanoFil מזרק, 100μl	העולם מכשירי דיוק	NANOFIL-100	כולל מחט טעינת לשימוש חוזר
D-PBS	Invitrogen	14040-117
GFP נוגדן	Aves	GFP-1020
DsRed נוגדן	Clontech	632496
חימום חסום	VWR	97042-610
ROSA26R העכבר	ג'קסון מעבדה	003309