In vivo שיטת לבדוק תפקוד הגנים במוח לאחר הלידה מתוארת. AAVs רקומביננטי להביע Cre ו / או חלבון פלואורסצנטי מוזרקים במוח העכבר הילוד. גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה מושגות, דבר המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד הגן בתהליכים קריטיים לפיתוח מעגלים עצביים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פסיפס ניתוח פונקציה ג'ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre
במאמר זה
סיכום
תקציר
תפקוד המוח רגיל נשענת לא רק על ההתפתחות העוברית כאשר מסלולים עצביים העיקריים מבוססים, אלא גם על התפתחות הלידה, כאשר מעגלים עצביים הם הבשילו ומעודן. Misregulation בשלב זה עשויה להוביל להפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות כגון סכיזופרניה, אוטיזם 1,2. גנים רבים נחקרו במוח טרום לידתי ומצא חיוני לתהליכים התפתחותיים רבים 3-5. עם זאת, תפקידם במוח לאחר הלידה אינו ידוע ברובו, בין השאר משום המחיקה שלהם בעכברים מובילה לעיתים קרובות הקטלניות במהלך התפתחות הילוד, וגם מפני הדרישה שלהם בהתפתחות המוקדמת מעכבת את הניתוח לאחר הלידה. כדי להתגבר על המכשולים הללו, floxed האללים של גנים אלה נמצאים בשלבי שנוצר בעכברים 6. בשילוב עם אללים מהונדס המבטאים Cre recombinase ב סוגי תאים מסוימים, המחיקה מותנית יכולה להיות מושגת ללמוד לתפקד גנים במוח לאחר הלידה. עם זאת, שיטה זו דורשת אללים נוספים תוספת זמן (3-6 חודשים) על מנת ליצור את העכברים עם גנוטיפים המתאימים, וכך להגביל את הרחבת הניתוח גנטית בקנה מידה גדול במוח העכבר.
כאן אנו משלימים להפגין גישה המשתמשת Cre virally-הביעו ללמוד אלה אללים floxed במהירות ובאופן שיטתי בהתפתחות המוח לאחר הלידה. באמצעות הזרקת רקומביננטי adeno הקשורים וירוסים (rAAVs) 7,8 קידוד Cre לתוך המוח בילוד, אנו מסוגלים למחוק את הגן של עניין באזורים שונים של המוח. על ידי שליטה על כייל ויראלי coexpressing סמן חלבון פלואורסצנטי, אנחנו יכולים להשיג בו זמנית גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה. שיטה זו עוקפת את הדרישה של גנים רבים בפיתוח מוקדם, מאפשר לנו ללמוד תפקוד התא האוטונומי שלהם תהליכים קריטיים רבים בהתפתחות המוח לאחר הלידה, כולל צמיחה axonal ו דנדריטים, מסתעפת, ו ריצוף, וכן היווצרות הסינפסה ועידון. שיטה זו שימש בהצלחה במעבדה שלנו (תוצאות לא פורסם) ואחרים 8,9, ו - ניתן להרחיב וירוסים אחרים, כגון 9 lentivirus, כמו גם לביטוי של חלבונים או shRNA פעיל דומיננטי 10. יתר על כן, על ידי שילוב של טכניקה זו עם electrophysiology וכן לאחרונה פיתחה כלי הדמיה אופטית 11, שיטה זו מספקת אסטרטגיה חדשה ללמוד איך מסלולים גנטיים המשפיעים על התפתחות המעגל העצבי לתפקד וגם עכברים וחולדות.
פרוטוקול
1. וירוסים הכנה הזרקה
- rAAVs נרכשו מהספק מסחרי מומלץ, אבל הם יכולים גם להיות מיוצר במעבדה של עצמו (ראה דיון בהמשך). הפתרון וירוס מופק בדרך כלל כייל של ~ 1x10 12 עותקים בגנום למיליליטר (GC / ml) וניתן להשתמש בו בכל titer מלא לתפעל מספר גדול של תאים. לחלופין, הם יכולים להיות מדולל כדי לייצר את הרמה הרצויה של תיוג דלילה. דילול המתאים צריכה להיקבע על ידי המשתמש, אלא דילול 1:10 מומלץ להתחיל.
- הפשירי וירוסים על קרח מיד לפני השימוש. העברת הרצוי מראש דילול נפח פתרון וירוס לתוך קטן (~ 250μ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה בילוד הזרקת נגיפי המוצג כאן מספק דרך פשוטה ומהירה ליצור בפסיפסים vivo לחקר התפתחות המוח לאחר הלידה. השיטה מנצלת אללים floxed הזמינים כעת וכן אלה הנעשים דרך הגן תפוקה גבוהה מיקוד הפרויקט 6. לעומת השימוש בביטוי מהונדס של Cre, שיטה זו מספקת דרך מהירה לבדוק את תפקוד הגנים סוגי תאים שונים, כמו עכברים שנשאו את אללים floxed ניתן להשתמש ישירות עבור ניסויים, ואת וירוס כל זריקה ההליך מתחילתו ועד סופו יכול להיות הושלמה בתוך פחות משעה. בנוסף, מספר תאים נגועים ניתן לש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
תודות
עבודה זו נתמכת על ידי מענק RO1 מ-NIH (NINDS).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| rAAV8-Cre,-GFP,-DsRed, | וקטור Biolabs | # 7060, # 7061, סדר מותאם אישית | http://www.vectorbiolabs.com |
| הרווארד משאבה 11 פלוס | הרווארד Apparatus | # 702208 | (אין יציאת דוושת רגל) |
| פיגמנט רשתית אפיתל הזרקת Kit | העולם מכשירי דיוק | הרשתית-KIT | מכיל חיבור, צינורות הזרקה ומחטים (36G), וכן בעל מחט |
| NanoFil מזרק, 100μl | העולם מכשירי דיוק | NANOFIL-100 | כולל מחט טעינת לשימוש חוזר |
| D-PBS | Invitrogen | 14040-117 | |
| GFP נוגדן | Aves | GFP-1020 | |
| DsRed נוגדן | Clontech | 632496 | |
| חימום חסום | VWR | 97042-610 | |
| ROSA26R העכבר | ג'קסון מעבדה | 003309 |
מקורות
- Geschwind, D. H., Levitt, P. Autism spectrum disorders: developmental disconnection syndromes. Curr Opin Neurobiol. 17, 103-111 (2007).
- Giedd, J. N., Rapoport, J. L. Structural MRI of pediatric brain development: what have we learned and where are we goin....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
