מאמר שיטה

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

DOI:

10.3791/2824

⸱

20 באפריל 2011

 ,  ,  , 
1Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, 2New Product Design Department, Fujirebio Inc.

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החלקיקים פיתחה לאחרונה רומן התלכדות (רש"פ) assay ניצול קולטן מולקולה וירוס איפשר זיהוי מהיר וקל של poliovirus (PV). במאמר זה, אנו נראה את הליך assay הרשות לצורך זיהוי PV.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ב גלובל פוליו חיסול היוזמה, אבחנה מעבדה משחק תפקיד קריטי ידי בידוד וזיהוי PV מן דגימות צואה של שיתוק רפה (AFP) במקרים אקוטיים. בארגון הבריאות העולמי (WHO) גלובל פוליו מעבדה רשת, PV בידוד וזיהוי כרגע מתבצע באמצעות תרבית תאים של המערכת בזמן אמת RT-PCR, בהתאמה. בעידן שלאחר מיגור של PV, הליכי זיהוי פשוטה ומהירה יהיה מועיל לאישור מהיר של מקרי פוליו במעבדות הלאומיות. במחקר הנוכחי, אנו נראה את ההליך של assay הרשות חדשנית שפותחה לצורך זיהוי PV. זה assay הרשות מנצל האינטראקציה של מולקולת PV (PVR) הקולטן virion כי הוא זיקה מסוימת ואחידה לכל קפסיד של PV. ההליך הוא פשוט (אחד הליך צעד צלחות תגובה) ומהירה (ניתן להשיג תוצאות בתוך שעות 2 של התגובה), והתוצאה היא נצפתה חזותית (תצפית של התלכדות של חלקיקי ג'לטין).

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת בינוני אחזקה (MM) וצמיחה בינוני (GM)

להכנת MM ו-GM, ראה מדריך מעבדה פוליו של WHO 1. מדיום שונה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 2% עוברית עגל בסרום (FCS) ו -10% FCS יכול לשמש תחליפים של MM ו-GM, בהתאמה.

2. הכנת נוגדנים נגד PV

  1. אנטי PV מחדש נוגדנים (PV RIVM הקלדה antiserum) על ידי הוספת מים (0.5 מ"ל בכל בקבוקון) כדי בקבוקון אחד של נוגדן אנטי PV (סוג 1, 2 או 3). הוסף פתרונות נוגדן מחדש (0.5 מ"ל כל אחת) כדי מ"ל של 4.5 מ"מ צינורות שכותרתו נפרד.
    הערה: יש המון נוגדנים נגד PV ניתנים כצורה מחדש (0.5 מ"ל בכל בקבוקון). במשך הרבה כאלה של נוגדנים נגד PV, תוספת של מים הכינון מחדש לא הכרחי.
  2. מערבבים נפח שווה של נוגדנים נגד PV מחדש. עבור אנטי PV1 2, 2 3, 1 או 3: מיקס 1.8 מ"ל של כל נוגדן מחדש (1.8 מ"ל + 1.8 מ"ל = 3.6 מ"ל של תערובת כל אחת). עבור אנטי PV1 2 3: מיקס 1.2 מ"ל של כל נוגדן מחדש (1.2 מ"ל + 1.2 מ"ל + 1.2 מ"ל = 3.6 מ"ל).
    הערה: דגימות PV יכול להכיל תערובת של סרוטיפים שונים של PV. כדי לזהות סרוטיפ אחת של PV בדגימות בתערובת של PVS, בריכות נגד PV נוגדנים (כלומר 1 2, 2 3, 3 1, 1 +2 +3) הוא הכרחי.
  3. מוסיפים 1 / 5 נפח של FCS (0.72 מ"ל) זה אנטי PV (1 2, 2 3, 3 +1, או 1 +2 +3) נוגדן (3.6 מ"ל כל אחד) (FCS 18.2% הסופי).
    הערה: תוספת של FCS הוא הפחתה של התלכדות בלתי ספציפיים של החלקיקים ג'לטין הנגרמת על ידי נוגדנים.
  4. שמור את בריכות נוגדן ב -20 ° C עד לשימוש assay הרשות.

3. הכינון של חלקיק ג'לטין רגיש

  1. הוסף 1.5 מ"ל של חיץ הכינון מחדש כלול בערכה על בקבוקון אחד של חלקיק ג'לטין רגיש (כאמור אבקת להקפיא מיובש).
  2. מערבבים היטב על ידי לחיצה עדינה
  3. שמור את החלקיקים רגיש מחדש ב 4 ° C. החלקיקים ג'לטין מחדש יכול להיות פעיל לפחות 2 שבועות שמר על 4 ° C, אבל צריך להיות מוכן לפני assay.

הערה חשובה:
אל תערבב הרבה שונים של חלקיקים ג'לטין רגיש, כי התמונה התלכדות של חלקיקים שאינם רגישים ג'לטין יכול להיות שונה על ידי הרבה של החלקיקים. עבור כל ניסוי, הרבה אחת של חלקיק ג'לטין רגיש אמור לשמש.

4. הרשות assay עבור PV זיהוי

  1. הכינו צלחת מיקרו טיטרציה. לצורך זיהוי של דגימה אחת וירוס, אנחנו צריכים 5 + בארות אחד לפחות שליטה שלילי (חלקיק רגיש ללא וירוסים נוגדנים, גם # 6 ב להלן. ראה שום שליטה וירוס נוגדנים בדוגמה). סה"כ מספר בארות הוא 5 + x דגימות לפחות שליטה assay.
    הערה חשובה:
    נא לקחת לפחות אחד לא לשלוט וירוס הנוגדן assay. בקבוקון אחד של החלקיקים הוא כ רגיש לזיהוי של 10 דגימות נגיף.
  2. הוסף 12 μL / היטב אנטי PV נוגדן או GM לצלחת מיקרו טיטרציה. סידור הצלחת הוא כדלקמן (ראה גם דוגמה בהמשך). בדגימות ללא נוגדנים (טוב # 1 ו - 6), להוסיף 12 μL של GM במקום אנטי PV נוגדן.
    הערה חשובה:
    אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב או מנפק יהיה מועיל עבור שלב זה.
    ובכן # 1 ובכן # 2 ובכן # 3 ובכן # 4 ובכן # 5 ובכן # 6
    ג'נרל מוטורס אנטי P1 2 3 אנטי P1 2 אנטי P2 3 ani-P1 3 ג'נרל מוטורס
  3. הוסף 12 μL / היטב מדגם וירוס. במדגם אחד ללא וירוס (טוב # 6), להוסיף 12 μL של GM במקום פתרון וירוס.
    הערה: מדגם וירוס הוא supernatant התרבות של תאים נגועים, תאים L20B בדרך כלל או תאים RD.
    הערה חשובה:
    אם רבים דגימות PV צריך להיבדק אצל assay זה, פיפטה רב יהיה מועיל עבור שלב זה.
    ובכן # 1 ובכן # 2 ובכן # 3 ובכן # 4 ובכן # 5 ובכן # 6
    וירוס מדגם וירוס מדגם וירוס מדגם וירוס מדגם וירוס מדגם ג'נרל מוטורס
  4. קח חלקיק מחדש פתרון רגיש מתוך 4 ° C לטמפרטורת החדר, לטפוח בעדינות לחלוטין להשעות את החלקיקים.
    הערה חשובה:
    לאחר השעיה מלאה של החלקיקים על ידי הקשה עדינים, חלקיקים יש להוסיף מיד את הצלחות לפני החלקיקים המרחפים precipitaטה והצורה הלא הומוגנית פתרון.
  5. הוסף 25 μL / טוב של חלקיק רגיש לכל הבארות.
    הערה חשובה:
    לאחר תוספת של חלקיקים רגישים, הצלחת לאלתר להיות כפופים להם לצלחת ערבוב להתחיל תגובה אחידה של הדגימות. לפיכך, תוספת של חלקיק רגיש צריך להתבצע באמצעות מתקן לצמצם פער הזמן בין דגימות הצלחת.
  6. שים את צלחת מיקרו טיטרציה על צלחת מיקסר מערבבים את הצלחת למשך 30 שניות.
  7. שים את צלחת מיקרו טיטרציה על נייר לבן (מטעמי נוחות של תצפית ויזואלית) על השולחן בטמפרטורת החדר (15 ~ 30 ° C) עבור 2 ח
    הערה חשובה:
    אל תזיז את הצלחת במהלך ואחרי התגובה להסתכלות התוצאות והתמונות לוקח. התלכדות שנוצר אינו יציב מופרעת בקלות על ידי הזזת צלחות.
  8. צלמו תמונות של הצלחת.
    הערה חשובה:
    נוף חלקי של התמונות לא יכול לתת מספיק נתונים לבדיקה ביקורת מאוחר יותר של תוצאות לפרשנות. כמה תמונות יש לנקוט כדי לכסות את כל הבארות של הצלחות התמקדות התמונה התלכדות של בארות.

5. פרשנות של התוצאות

  1. זיהוי בארות חיוביים ושליליים. השווה את התלכדות בדגימות עם זה של שליטה וירוס נוגדנים לא (משקעים של חלקיקים ג'לטין, התלכדות לא) (איור 1 ו - 2). תמונות של התלכדות כי יש להבחין בבירור מן הנגיף לא ולא לשלוט נוגדן (לא התלכדות, שליטה שלילי) יש לשפוט חיובית, ותמונות של התלכדות דומים שליטה שלילי צריך להישפט כמו שלילית. דוגמאות שמראות התלכדות ברורה אך חלקית בלבד יכול להישפט חיובית, אבל שיא כמו 'חיובי (התלכדות חלקית) ".
  2. זיהוי של PV. לפרש את תוצאות המבוססות על בארות חיוביות ושליליות עם אנטי PV הנוגדנים לזהות קפסיד PV. עקרון הפרשנות של התוצאה היא דומה לזו של בדיקת נטרול במערכת תרבית תאים (לדוגמה חיובית עבור נוגדן אנטי-P1 2 עולה כי המדגם מכיל 3 סוג PV).

6. נציג תוצאות

התוצאה נציג הרשות assay PV זיהוי מוצג באיור 1. כל זני PV נוצר התלכדות של חלקיקים רגישים ג'לטין (אין נוגדנים דגימות). בנוכחות נוגדנים המתאימים אנטי PV, משקעים של חלקיקים ג'לטין (התלכדות לא) דומה וירוס לא ולא לשלוט נוגדנים (שליטה שלילי) נצפתה (למשל, PV1 (סבין) בנוכחות אנטי P1 או 2 אנטי P3 1 נוגדנים).

figure-protocol-1
באיור 1. וירוס פתרונות זיהוי PV ידי assay הרשות. PV1 של (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 1.2 x 10 8 CCID 50 / 12 μL, 8.2 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, ו 3.5 x 10 7 CCID 50 / 12 μL, בהתאמה) שימשו לזיהוי על ידי assay הרשות. אין וירוסים אין שליטה נוגדנים הראתה משקעים של חלקיקים ג'לטין (לא התלכדות, שליטה שלילי).

figure-protocol-2
איור 2. פרשנות בארות חיוביים ושליליים. פתרונות וירוס של PV1 (סבין), PV2 (סבין), ו PV3 (סבין) (titers וירוס של 2.4 x 10 μL 8 50/25 CCID, 1.7 x 10 8 CCID 50 / 25 μL, ו 7.3 x 10 7 CCID 50 / 25 μL, בהתאמה) היו מדוללים 1 / 20 עד 1 / 320, ולאחר מכן 25 μL של דגימות בדילול נבחנו על ידי הרשות assay ללא אנטי PV נוגדנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנקודה הייחודית של assay זו הרשות היא ניצול של המולקולה PVR במקום אנטי PV נוגדנים לצורך זיהוי של PV 2. זה מאפשר אינטראקציה ספציפית של חלקיקי ג'לטין רגיש עם PV עם זיקה אחיד לכל שלושת קפסיד של PV 3-6. השתמשנו צורה immunoadhesin של PVR (PVR-IgG2a) עבור סנסיטיזציה של חלקיקי ג'לטין, כי צורות monomeric של PVR יש רק זיקות מתונה לאתר קישור יחיד על virion (ניתוק קבוע של 10 ~ -7 -8 M) 7, 8, וצפו בהצלחה התלכדות מסוימת של חלקיקי ג'לטין רגיש עם מבוד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Souji Masujima הוא עובד של מוצר חדש מחלקת עיצוב, Fujirebio בע"מ

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים Junko ואדה לקבלת סיוע טכני מעולה שלה. אנו מודים לפרופ 'אקיו Nomoto עבור באדיבות מתן וקטור ביטוי baculovirus עבור PVR-IgG2a. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקי-in-Aid לקידום פוליו חיסול ומחקר על מתעוררים מחדש המתעוררים מחלות זיהומיות של משרד העבודה הבריאות, והרווחה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
שם מגיב חברה מספר קטלוגי תגובות
רגיש, ג'לטין חלקיקים Fujirebio בע"מ מבחן הערכה
הכינון חיץ Fujirebio בע"מ מבחן הערכה
Microtitration צלחת Fujirebio בע"מ מבחן הערכה
Anti-PV נוגדן RIVM

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. World Health Organization. Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).
  2. Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus. J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).
  3. Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. Interaction of poliovirus with its cell surface binding site. Virology. 201, 107-115 (1994).
  4. Koike, S. The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms. Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).
  5. Mendelsohn, C. Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).
  6. Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily. Cell. 56, 855-865 (1989).
  7. Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion. J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).
  8. McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor. J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).
  9. Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro. J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).
  10. Avoort, H. G. vander Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses. J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).
  11. Kilpatrick, D. R. Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues. J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96

מאמרים קשורים