שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי

סיכום

כאן, הקמנו שיטה לבדיקת יעילות התרופה עם דגימות כירורגית של גידולים במוח, המכונה "שיטת explant הגידול". באמצעות שיטה זו, אנו יכולים להעריך את יעילות התרופה בלי לשבור את microenvironment של גידולים מוצקים. כדי לאמת את האמינות של שיטה זו, אנו מתארים נתונים עם נציג הדגימה glioma שלנו שטופלו הסוכן קו ראשון הנוכחי כימותרפיות, temozolomide.

תקציר

טיפולים שוטפים עבור glioma ממאיר יש רק אפקט פליאטיבי. לפיתוח טיפולית, משוכה אחת היא אי התאמה של יעילות נקבע על ידי הנוכחית יעילות בדיקות סמים את היעילות על חולים. לכן, שיטות רומן אמין להערכת יעילות התרופה הם ערובה בשלב טרום קליניים. בתרבות במבחנה של רקמות הגידול, כולל שורות תאים, יש שינויים פנוטיפי, גנטית, epigenetic משמעותי בתאי סרטן נגרם על ידי הסביבה המלאכותית של תרבית תאים, אשר אולי לא משקפים את הביולוגיה של גידולים המקורי באתרם. מודלים xenograft עם העכברים immunodeficient גם יש מגבלות, כלומר, היעדר מערכת החיסון interspecies פערים גנטיים epigenetic ב microenvironment. הנה, אנחנו מדגימים שיטה חדשה באמצעות דגימות כירורגית של glioma ממאיר כאבני הגידול undissociated כדי להעריך השפעות הטיפול. כדי לאמת בשיטה זו, הנתונים עם סוכן קו ראשון הנוכחי כימותרפיות, temozolomide (TMZ), מתוארים.

השתמשנו הדגימה שאך להסיר כירורגית של glioma ממאיר לניסויים שלנו. ביצענו הזרקה intratumoral של TMZ או לתרופות אחרות, ואחריו הדגירה ניתוח כירורגי על דגימות. כאן, ביקשנו להקים שיטת הגידול explant רקמות כפלטפורמה כדי לקבוע את יעילותם של טיפולים נגד סרטן הרומן, כך נוכל להתגבר, לפחות, חלק מן המגבלות הנוכחיות למלא את הפער הקיים בין הניסוי הנוכחי נתונים על יעילות על גידול של המטופל בפועל. שיטה זו עשויה יש פוטנציאל להאיץ זיהוי תרופות כימותרפיות חדשנית לטיפול בסרטן מוצק.

פרוטוקול

1. הכנה של התקשורת

1. התקשורת הוכן באמצעות 10% FBS (16140-071 - GIBCO) ב DMEM/F-12 (1X), נוזלי 01:01 (10565-042 - Invitrogen) עם פתרון אגר 0.6% מטוהרים, מגורען (1.01614.1000-EMD ). בתנאים סטריליים נשמרו לאורך כל הניסוי.
2. להכנת 5 מ"ל התקשורת של FBS (16140-071 - GIBCO) נוספה 45mL של DMEM/F-12 (1X), נוזלי 01:01 (10565-042 - Invitrogen) שהופך נפח סופי של 50 מ"ל. התקשורת מוכנה הוחזק אמבט מים בטמפרטורה 37 ° C.
3. הפתרון אגר הוכן באמצעות שיטת במיקרוגל החום. 0.3 גרם אגר היה מגורען מומס במים מזוקקים 50 מ"ל באמצעות מיקרוגל. הפתרון אגר היה מגניב עד 37 ° C טמפרטורה ידי שמירה על אותה לאמבטיה מים.
4. השתמשנו נפח שווה של מדיה מן צעד 1.2 ו - 1.3 פתרון מלאי מוכן. יחס אגר 0.6% (0.5mL) ו -10% FBS-D-MEM/F-12 מדיה (0.5mL) היה 01:01, מה שהופך את הנפח הכולל של 1 מ"ל היטב כל אחד 6 צלחות היטב.

2. עיבוד רקמות

1. Glioblastoma multiforme (GBM) ברקמות התקבלו מיד לאחר הניתוח מן המחלקה לפתולוגיה. הרקמה סווגה GBM מן המחלקה לפתולוגיה.
2. רקמה הועבר צלחת patri באמצעות מלקחיים ובזהירות ורחץ עם קרים כקרח 1XPBS 5 מ"ל במשך 3 פעמים.
3. סעיפים סידורי הדגימות נחתכו מן דגימות גזור ליצור בלוקים הגידול (בקירוב 10 מ"מ קוטר) עם להב כירורגי (Feather-2976 # 10) המלקחיים (פישר סיינטיפיק).
4. בלוקים הועברו לתוך צלחת 6 באר. כל 1mL גם היה המכיל התקשורת להזכיר בשלב 1.4. הרקמה היתה חשיפה מספיק אוויר כדי לשמור על רקמת קיימא.
5. בלוקים גידול הוזרקו אז גם עם DMSO (5%) או TMZ (2.5 ננומטר) מודגרות עבור 16 שעות 37 מעלות צלזיוס באוויר humidified CO2 המכיל 5%. 0.1mL של DMSO (5%) או TMZ היה מוזרק 3 פעמים גושי גידולים במקומות שונים לטיפול עקבי. התרופה היה מוזרק באמצעות מזרק אינסולין 1mL 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (נוחות נקודה 26,027).
6. לאחר 16 שעות בלוקים נשטפו עם 5 1XPBS מ"ל במשך 3 פעמים. אחרי כביסה אבני תוקנו עם 10 מ"ל של 10% v / v פורמלין למשך 24 שעות (החברה Ricca כימי) בתוך 50 מ"ל צינורות (Basix-5539802) ומעובד פרפין מוטבע 4μm חלקים.
7. סעיף קבוע פורמלין הונחה כוס בצלחת ומערבבים עם "חימום" ומעובד באמצעות הפתרונות הבאים במשך 30 דקות כל פתרון. אתנול 30%, אתנול 50%, אתנול 75%, אתנול 80%, אתנול 95%, 100% אתנול, ו - קסילן.
8. הרקמה נמחק על מגבות נייר והושמו פרפין נמס (58 עד 60 ° צלזיוס, פרפין פישר Paraplast) במשך 30 דקות.
9. הרקמה היה מוטבע באמצעות תבניות Surgipath פרפין Blue Ribbon, רקמה מוטבע קוררו לטמפרטורת החדר.
10. מוטבע פרפין סעיפים 4μm רקמות שנלקחו והניח בשקופיות פישר פלוס.

3. אימונוהיסטוכימיה

אימונוהיסטוכימיה בוצע כפי שתואר לעיל. ¹

1. Deparaffinization ומקום התייבשות השקופיות במעמד ולבצע את השלבים הבאים. קסילן עבור 3x5 דקות (3 פעמים במשך 5 דקות), 100% אתנול דקות 3x5, אתנול 95% במשך דקות 1x5, אתנול 70% עבור 1x5 דקות, לשטוף במים זורמים ברז במשך 3 דקות.
2. Antigen אחזור עם חום הנגרמת epitope שקופיות אחזור לטבול חיץ ציטראט 1X (Thermo Scientific-AP9003-500) מדולל במים מזוקקים בכוס זכוכית. מרתיחים במשך 15 דקות על פלטה חשמלית (לוודא סעיפים דון "לא ליפול השקופית). פתרון מגניב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם 1X PBS עבור 3x5 דקות.
3. עיכוב של מי חמצן פנימי לטבול את השקופיות של מתנול (פישר סיינטיפיק-A-452-4) עם מי חמצן 0.3% (פישר סיינטיפיק-BP2633-500-מדולל במים מזוקקים) בכוס זכוכית למשך 15 דקות. יש לשטוף ב 1X PBS עבור 3x5 דקות.
4. חסימת כיסוי הרקמות עם סרום 10% עז נורמלי. העברת שקופיות בתוך קופסה לח דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. שטפו את השקופיות עם 1X PBS עבור 3x5 דקות.
5. מדורים נוגדן ראשוני הודגרו לילה ° C עם נוגדן ראשוני בריכוזים הבאה 4: caspase-3 אנושי ספציפי (1:1,000, R & D מערכות, AF835), Ki67 (01:01, Dako, 15626) מדולל 1X PBS. שטפו את השקופיות 1X דקות PBS 3x10 ביום המחרת.
6. תגובת נוגדנים משני מכסים את רקמות עם 2-3 טיפות של נוגדן הנקרא HRP משנית (לדמיין מערכות). שים שקופיות בתוך קופסה לח דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף עם 1X PBS עבור 3x10 דקות.
7. איתור לפתח עבור DAB אב צבע ערכה (וקטור מעבדות-SK-4100) לאיתור נוגדן ראשוני הבאים פרוטוקול של היצרן.
8. מכתים מונה לטבול את השקופיות עם hematoxylin (15/10 s econds, ודא דון "לא מוצף DAB אות). לשטוף עם מים זורמים ברז במשך 3 דקות.
9. לטבול התייבשות השקופיות כדי שלאחר מכן, אתנול 70% במשך 5 דקות, אתנול 95% במשך 5 דקות, 100% אתנול דקות 3x5, קסילן עבור 3x5 דקות.
10. כיסוי להחליק את השקופיות עם מגיב הרכבה permount (פישר סיינטיפיק-SP-15-100).
11. תמונות שנלקחו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אולימפוס (DP-72) .3.11). בניסויים כל, תיוג ספציפית אושרה על ידי שליטה שלילי ללא נוגדן ראשוני.

4. נציג תוצאות:

אספנו דגימות כירורגית של multiforme glioblastoma (GBM). החולים שעברו את הניתוח הראשון ללא chemotherapies לפני כולל temozolomide (TMZ). התמונה T1-המשוקלל של בדיקת MRI עם גדוליניום שיפור באיור-1a הראו גידול משופרת באונה המצחית הימנית לפני הניתוח. התמונה לאחר הניתוח (איור-1b) אישר סכום ביניים של הסרת הנגע לאחר הניתוח. רקמות כירורגית נשלחו המחלקה לפתולוגיה לצורך אבחון קליני, ואת דגימות הנותרים עובדו על רכש את הרקמה תחת עמוד אישרה סקירה מוסדיים (IRB) פרוטוקול בבית של אוניברסיטת מדינת אוהיו המרכז הרפואי. Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים הפגינו נוכחות של נמק, תאים pseudopallisading, ועל כלי הדם התפשטות (איור 1-c). לכן, גידולים אלה אובחנו histopathologically כמו GBM. ראוי לציין, explants הגידול הבאים הדגירה ללא TMZ עד 48 שעות שמרו על cytoarchitecture של GBM. לעומת זאת, עם הדגירה של 72 שעות או יותר, שמנו לב מספר גדל של גרעינים מרוכז בדגימות, דבר המצביע על כמה תאים סרטניים מתחילים עוברים אפופטוזיס. כתוצאה מכך, רקמת הגידול הבאים הדגירה כבר הכילה אזורים בלתי סדיר כי איבד תאים סרטניים, אשר נצפו ליד מעדיפים סביב אזורים נמקי (מידע לא מוצג).

על מנת לחקור אם אלה דגימות explant הגידול יכול להיות מנוצל באופן מהימן לצורך בדיקת יעילות התרופה, בדקנו את ההשפעה של טיפול TMZ. תרשים 2 מייצג את הזרימה של הניסויים במחקר זה. מחקר שנערך לאחרונה עולה כי הזרקה intratumoral של TMZ יש השפעה חזקה יותר על בקרת הצמיחה של glioma ממאיר מזו של ממשל מערכתית של תרופה זו ^2. לאחר דגירה של 16 שעות, explants אלה היו מוטבעים עם פרפין וחתכים סדרתי מוכנים מכתים. אימונוהיסטוכימיה של TMZ שטופלו רקמות GBM הפגינו צמצום משמעותי של Ki-67 חיובי תאים סרטניים בהשוואה דגימות שליטה. בתורו, אימונוהיסטוכימיה עם סמן אפופטוזיס, caspase-3, לא הניב שום הבדל משמעותי בין TMZ שטופלו דגימות glioma לבין דגימות הביקורת (איור 3).

השפעת טיפול עם TMZ התאפיינה יותר על ידי שילוב זה יחד עם assay explant או בתרבות חוץ גופית או cytometry הזרימה. באופן ספציפי, אנחנו ביקשו לקבוע את ההשפעה על תאים כמו בתאי גזע סרטניים (SCLTC). לכן, לאחר הטיפול intratumoral עם TMZ, הופענו assay כדור להרכיב cytometry זרימה של אלה explants הגידול. TMZ שטופלו דגימות היו ניתק לתוך תאים בודדים בודדים אלה תאים בודדים היו זורעים בצפיפות נמוכה (1 תאים לכל microliter או התחתון) של צלחות 96-היטב במדיום סרום ללא בתוספת bFGF ו EGF. בקבוצת הביקורת, היווצרות הגידול בתחומים מן explants הגידול נצפתה לאחר דגירה 7 יום. בהתחשב בכך היווצרות כדור הוא מאפיין של SCLTC ^{3 4,} שינויים במספר תחומים הגידול על ידי טיפול בתרופה מעיד על השפעה על SCLTC. באופן דומה, cytometry זרימה של explants הגידול ניתק עם סמן תא השטח, CD133, בוצע כדי לוודא את ההשפעה על SCLTC. אם SCLTC בתאי גידול הטרוגניות GBM הושרשו סלקטיבי על ידי טיפול תרופתי, ניתן לנבא כי cytometry זרימה אמור לזהות ירידה של שבריר CD133 חיובי על ידי טיפול (מידע לא מוצג).

Figure.1 תמונות תהודה מגנטית (MRI) של GBM חולה. דמויות נציג מבצע טרום איור-1a שלאחר הניתוח איור-1b. איור-1c הוא H & E מכתים המדגם GBM טרי רקמות. ההגדלה המקורי, 40X.

איור. 2 זרם ניסיוני של הניסוי תרבות לחסום. באיור-2a. תמונה של GBM כירורגית טרי שהתקבלו המחלקה לפתולוגיה. איור מראה Dissection-2b של גוש הגידול לחתיכות קטנות 10mm בלהב כירורגי לעזור. איור-2c היא (TMZ) תרופה לטיפול בלוקים הגידול באמצעות מזרק אינסולין.

ה 3 "/>
איור. 3 אימונוהיסטוכימיה. אימונוהיסטוכימיה של גושי רקמה GBM הזריקו DMSO או TMZ עם הפעלת caspase-3 ו Ki67. Hematoxylin שימש מכתים גרעיני. ההגדלה המקורי, 40X.

דיון

קיים פער בין יעילות התרופה ב טרום קליניים המודלים הנוכחיים ניסיוניים את יעילות בחולים. באופן ספציפי יותר, בשדה גידול במוח מחקר, שיטות הרומן ואמין נדרשים שיעזור למלא את הפער הקיים בין הערכת התרופה עם השיטות הקיימות ואת יעילות בחולים. Assay המתוארים במחקר זה הוא נכס נוסף, אם לא פתרון, כדי להקל על מילוי הפער של נתונים ניסיוניים תוצאה של חולים מושפע.

בתרבויות במבחנה תא מעדיפים להרחיב את התא סוגי גידולים מסוימים, ללא קשר לתנאי התרבות, מייצגים רק subpopulation של הגידול כולו. ⁵ בנוסף, שינוי גנטי פנוטיפי של התפשטות תאים מלאכותיים מתרחשת היא בלתי נמנעת עם לטווח הארוך בתרביות תאים . אחד המכשולים העיקריים לטיפול glioma ממאיר הוא ההטרוגניות של תאים סרטניים, הן בתוך הגידול יחיד בין דגימות גידולים ^{6, 7.} לכן, העשרה סלקטיבית של אוכלוסיה מסוימת של תאים סרטניים, ללא תלות בסוג זה או אחר, לא יכול להיות אמצעי מתאים כדי לקבוע את היעילות של תרופות כימותרפיות על כל התאים הסרטניים הטרוגנית. ^{8 9} כל מודל חיה של גידולים במוח נגזר subpopulation של תאים סרטניים לשפוך אור על יעילות התרופה על subpopulation, אבל לא את הגידול כולו.

מספר מגבלות, מצד שני, עדיין נשארים בשיטה זו explant הגידול. מגבלה אחת כזו היא תקופה קצרה יחסית של טיפול. מאז תאים סרטניים ממאירים נחשבים לרכוש עמידות ביותר, אם לא כולם, טיפולים לאורך זמן, שליטה ראשונית של צמיחה לטווח קצר תאים סרטניים לא יכול להיות לידי ביטוי פרוגנוזה לטווח ארוך של המטופל, כפי שדווח לאחרונה עם אנטי סוכן angiogenic, ¹⁰ bevacizumab. לכן, שיפור של פרוטוקול עבור assay זה explant לשמר רקמות לתקופה ארוכה יותר יש צורך בחקירות נוספות. שאלה נוספת היא השפעה ספציפית של תרופה נבדק על SCLTC בגידול. בהתחשב בכך SCLTC עמידים יחסית בפני טיפולים שוטפים עבור glioma ממאיר, זיהוי של תרופות נוגדות סרטן רומן potently לבער SCLTC היא מוצדקת. בהקשר זה, אנחנו כרגע מחפשים לשלב זה assay explant עם הבאים בניסויים במבחנה, כגון assay להרכיב neurosphere (מידע לא מוצג). אנו מצפים ללמוד יותר על ההשפעות, אם בכלל, של מועמד התרופה על SCLTC באמצעות מבחני אלה גם יחד. לבסוף, בעזרת קוביות קטנות של דגימות הגידול לא יכול לשקף את התא אוכלוסיות שלמות הגידול, כפי שקורה עם תא קווי רגיל או תרבויות הגידול העיקרי של דגימות כירורגית. נושאים אלה בצד, שמירה stroma הגידול, כולל נישה כלי הדם, מסייע באפיון הגורמים הסביבתיים על תאים סרטניים. לכן, assay זה עשוי להיות פוטנציאל להעריך כל אסטרטגיות טיפוליות תחת מצב יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

כאן, הקמנו assay לבדיקת יעילות התרופה עם explants דגימות כירורגית של GBM. למעשה, עם דגימות כירורגית שנבדקו, מצאנו כי הזרקה ישירה של TMZ מפחית שגשוג של דגימות GBM. שיטה זו explant רקמות ישים תיאורטית סרטן מוצקים אחרים ומספק הנכס כדי לקבוע יעילות התרופה על גידול של המטופל, אשר בתקווה לעזור לנו למנוע עוד כישלון בניסויים קליניים עבור סרטן.

חומרים

שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
עוברית שור סרום, מוסמך, חום מומת	GIBCO	16140-071
D-MEM/F-12 (1X) נוזלי 01:01	Invitrogen	10565-042
Agar-agar מטוהרים, מגורען	EMD	1.01614.1000
DPBS עבור מכתים	Invitrogen	14190
Hematoxyllin	Richalrd אלן מדע	7211
10% w / v caspase-3 פורמלין	Ricca חברת כימיקלים	3810
Caspase-3	R & D מערכות	AF835
Ki67	Dako	15626
DMSO	סיגמא	D2650
דמיינו מערכת אנטי העכבר	Dako	2012-07
דמיינו מערכת נגד ארנב	Dako	2011-12
DAB-Kit	וקטור מעבדה.	SK-4100

טבלה 1. חומרים.

שם הציוד	חברה	מספר קטלוגי
6 ובכן פלייט	גריינר ביו one	657160
צלחת פטרי	VWR	25384-302
סרולוגית פיפטה	Axygen
סנן טיפים	ארה"ב מדעי
פוליאסטר 500 מיקרומטר רשת Netwell להכניס	שחקן המשנה	3480
Matrigel מטריקס	BD Biosciences	354230
BD מזרק 10 מ"ל	BD מדעי החיים	309604
מחט המזרק אלומיניום Hub.	טייקו בריאות	2000029
תרבות רקמות צפחת	קורנינג
צנטריפוגה צינורות	Basix	5539800
קיר דק צינורות	איטון	1107A
כירורגי Blade נירוסטה	נוצה	2976 # 10
מזרק אינסולין	נוחות נקודה	26027
50 מ"ל כובע שטוח העליון בורג צינור	Basix	5539802
Dissection מיקרוסקופ	Tritech
מיקרוסקופ פלואורסצנטי	אולימפוס	DP-72
המלקחיים	פישר Sci

2. טבלה ציוד.