חלקיקים ניאון למדידה של ריכוז יון במערכות ביולוגיות

סיכום

חלקיקים פלורסנט המיוצר במעבדה שלנו משמשים ריכוזי הדמיה יונים והנתיבים יון במערכות ביולוגיות כגון תאים במהלך נוזל איתות ביניים במהלך הומאוסטזיס פיזיולוגיים.

תקציר

הומאוסטזיס יון מוסדר היטב בכל הגוף הוא הכרחי למניעת מצבים מתישים כגון התייבשות. ¹ לעומת זאת, והנתיבים יון מהיר ברמה התאית נדרשים ליזום פוטנציאל פעולה בתאי להתרגש. תקנה ² נתרן משחק תפקיד חשוב בשני במקרים אלה, אולם השיטה לא קיימת כיום עבור ניטור רציף רמות נתרן in vivo ³ ו ⁴ בדיקות נתרן תאיים אינם מספקים תוצאות מפורטות דומה כמו בדיקות סידן. במאמץ למלא את שני החללים הללו, nanosensors פלורסנט פותחו יכול לפקח על ריכוזי הנתרן במבחנה in vivo. ^5,6 חיישנים אלה מבוססים על טכנולוגיית יון סלקטיבי optode וכוללת חלקיקי פלסטיק פולימרי, שבו הכרה נתרן ספציפי אלמנטים, pH רגיש fluorophores, ותוספים המוטבעים. ^7-9 מכני, אלמנט הכרה נתרן תמציות נתרן לתוך החיישן. ¹⁰ ממוצא זה גורם fluorophore pH רגיש לשחרר יון מימן כדי לשמור על ניטרליות מטען בתוך החיישן אשר גורם שינוי פלואורסצנטי. החיישנים נתרן הם הפיכים וסלקטיבית עבור נתרן ואשלגן על תאיים גם בריכוזים גבוהים. ⁶ הם כ 120 ננומטר בקוטר והם מצופים פוליאתילן גליקול להקנות biocompatibility. באמצעות שימוש בטכניקות microinjection, חיישנים יכול להיות מועברת לתוך הציטופלסמה של תאים שם הם הוכחו לפקח על הדינמיקה נתרן ומרחב המכות myocytes לב. ¹¹ בנוסף, יש להם גם מעקב בזמן אמת שינויים בריכוז הנתרן in vivo כאשר הוא מוזרק תת עורי לעכברים ³ בזאת, אנחנו מסבירים בפירוט ולהפגין את המתודולוגיה בודה nanosensors נתרן הניאון בקצרה להדגים את יישומים ביולוגיים המעבדה שלנו משתמשת nanosensors עבור:. microinjection של חיישנים לתוך התאים, ועל הזרקה תת עורית של החיישנים לעכברים .

פרוטוקול

1. הכנת optode

לפני ביצוע optode, aliquots הרכיבים הם זקוקים, כך שהם יכולים להימדד בקלות מאוחסן.

1. 50 מ"ג נתרן Ionophore X (NaIX) בקבוקון ו 50 מ"ג נתרן tetrakis [3,5-bis (trifluoromethyl) פניל] borate (NaTFPB) יהיה כל להיות גדל tetrahyrdofuran (THF) ו aliquoted לתוך 1.5 פוליסטירן צינורות מ"ל צנטריפוגות. במנדף כימי קטר, לפזר את 50 מ"ג של NaIX ב 1 מ"ל של THF בבקבוקון המשלוח ומערבבים כדי להבטיח מוצק נמס לחלוטין. העברת 100 μl של פתרון זה תוך 10 צינורות צנטריפוגה נפרד. חזור עבור NaTFPB. אפשר THF להתאדות במנדף כימי קטר בן לילה, התווית צינורות צנטריפוגה ומניחים אותם במקרר 4 מידה לאחסון. זה יוצר aliquots 5 מ"ג NaIX יבש NaTFPB.
2. ממיסים את השלישי Chromoionophore (CHIII) ב 1 מ"ל של THF ולהעביר בקבוקון זכוכית 3 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של THF על הבקבוקון משלוח CHIII לפזר כל CHIII שיורית ולהוסיף את זה הבקבוקון מ"ל 3 כוס. יהיו סך של 2 מ"ל עכשיו. העברת 1 מ"ל של CHIII בפתרון THF לשני נפרד 1.5 כוס בקבוקוני מ"ל עם כמוסות מצופה טפלון. אחסן את הפתרון CHIII במקרר 4 תואר בריכוז הסופי של 5 מ"ג / מ"ל.

Aliquots אלו פתרונות ישמשו כדי להפוך את החומר optode.

3. פיפטה 66 μl של bis (2-ethylhexyl) sebacate (DOS) לתוך מבחנה 1.5 מ"ל עם מכסה זכוכית מצופה טפלון בורג - זה בקבוקון optode. DOS היא פתרון צמיגה כך יש להקפיד על מנת להבטיח את הכמות הנכונה של פתרון מועבר הבקבוקון. הכרך המתאים מ"ג 60 ~ של DOS.
4. לשקול את 30 מ"ג כלוריד גבוהה מולקולרית פולי (ויניל) משקל (PVC) ולהעביר את זה הבקבוקון optode.
5. עכשיו להוסיף את המרכיבים הפונקציונליים aliquoted אל הבקבוקון optode כדי ליצור את optode הרצוי. הריכוזים היחסיים של CHIII, NaIX ו NaTFPB תקבע את התגובה של החיישן כדי נתרן. ריכוזים אלה יכולים להיות מותאמים יש חיישן אידיאלי מגיב תאיים ריכוזי, עם Kd של 10 מ"מ, או ריכוזי תאית, עם Kd של 150 מ"מ. בנוסף, יהיו ככל הנראה אצווה כדי השתנות אצווה של כימיקלים מהספק וכיול של חיישנים הוא הכרחי כדי לקבוע אם התשובה הנכונה מתרחשת עבור כל אצווה חדשה של רכיבים כימיים. כאן אנו מתארים את השיטה כדי ליצור חיישן עם ריכוזים המשמשים בדרך כלל עבור מדידות נתרן תאיים.
6. במנדף כימי קטר, להעביר 100 μl של 5 מ"ג / מ"ל ​​CHIII בפתרון THF על הבקבוקון optode.
7. ממיסים 5 מ"ג NaIX ב 300 μl של THF ולהעביר 300 μl אל הבקבוקון optode, זה בקורלציה ל 5 מ"ג של NaIX.
8. ממיסים aliquot 5 מ"ג NaTFPB ב 500 μl של THF והעברת 20 μl של הפתרון הבקבוקון optode, זה בקורלציה ל 0.1 מ"ג של NaTFPB.
9. הוסף 80 μl של THF על הבקבוקון optode.
10. הפתרון של הבקבוקון optode מכילה 30 מ"ג של PVC, 60 מ"ג של DOS, 5 מ"ג NaIX, 0.2 מ"ג NaTFPB, 0.5 מ"ג CHIII ב 500 μl של THF. מערבולת זו הבקבוקון בעדינות עד שכל PVC נמס. Optode צריך להיות בצבע אדום. הסכום הכולל של THF הוסיף הבקבוקון צריך להיות 500 μL ללא יחס של רכיבים בשימוש.
11. אפשר THF שנותרו NaIX ו aliquots NaTFPB להתאדות לילה מחדש התווית צינור עם כמות נכונה של חומר כימי.

2. יצירת nanosensors

1. פיפטה 100 μl של 10 מ"ג / מ"ל 1,2-Distearoyl-SN-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N - [Methoxy (Polyethyleneglycol) -550] בכלורופורם (PEG-השומנים) לתוך בקבוקון 4 כוס משקה. אפשר כלורופורם להתאדות במנדף כימי קטר. תהליך זה יכול להיות מזורזת על ידי ייבוש הפתרון עם גז חנקן או אוויר בבית.
2. הוסף 4 מ"ל של מימית הפתרון הרצוי בקבוקון עם השומנים-PEG. מניחים את הצנצנת על שקע מעבדה מתחת קצה sonicating ולהעלות את הבקבוקון עד הקצה הוא כ 7 מ"מ עמוק הפתרון ו sonicate בהספק sonication נמוכה למשך 30 שניות. כאן אנו משתמשים דיגיטלי ברנסון sonifier להגדיר משרעת של 15% עם קרן ½ אינץ' קצה בקוטר צעד. בתמיסה מימית ניתן שום פתרון. לדוגמה, כדי לקבוע את התגובה של החיישנים נשתמש 10 mM HEPES pH 7.2 עם בסיס trizma.
3. אמנם הפתרון הוא להיות sonicated, לערבב 50 μl של החומר optode עם 50 μl של dichloromethane בתוך צינור microcentrifuge 0.6 מ"ל. מערבבים עם פיפטה כדי להבטיח ערבוב אפילו.
4. כוון את sonifier כדי sonicate במשך 3 דקות. הפעל את sonication ובעוד sonicating להוסיף את תערובת פתרון optode אל הבקבוקון ידי טבילה קצה פיפטה לתוך הפתרון מחלק 100 μl של פתרון מהיר אפילו זריקה אחת,. הפתרון צריך להפוך לכחול, depending על מימית הפתרון בשימוש.
5. אפשר sonication להמשיך למשך כ 30 שניות ואז להנמיך את המגבה כך טיפ sonicating הוא כ 2 מ"מ עמוק פתרון. זה צריך להתחיל לאורר את הפתרון ואת הפתרון יהיה אטום. פעולה זו מסייעת להסיר את THF dichloromethane שיורית ומן הפתרון.
6. לאחר sonication תושלם, להרים את הפתרון nanosensor לתוך מזרק 5 מ"ל. צרף 0.2 מיקרומטר מזרק לסנן ולחלק את הפתרון nanosensor לתוך בקבוקון זכוכית עם מכסה בורג בראש. הפתרון צריך להיות ברור וכחול אם בתמיסה מימית המכילה פחות מ -10 מ"מ נתרן יש pH פחות מ על 9 משמש. אחרת, זה צריך להיות ללא צבע או ורוד.

3. קביעת התגובה nanonsensor

שיטה זו משמשת כדי לקבוע את התגובה של nanosensors תוכנן כדי למדוד נתרן תאיים. ריכוזים שונים מומלץ לשמש nanosensors ריכוז תאי נתרן.

1. הפוך את פתרונות מלאי של 10 mM HEPES (0 Na) ו 1M נתרן כלורי (NaCl) ב 10 mM HEPES (1 M Na) ו-pH של כל הפתרונות הללו על 7.2 באמצעות בסיס trizma. מיקס פתרונות המניות של 0 ו -1 Na ​​Na M ב 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטי כדי ליצור פתרונות עם: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 NaCl בריכוז mM.
2. השתמש התחתונה אופטי 96 צלחת גם כדי לקבוע את התגובה. הוסף 100 μl של ריכוז כל אחד נתרן 3 בארות בעמודה. זה יהיה לייצר מערך של 3 x 10 בארות.
3. כדי להוסיף גם כל 100 μl של nanosensors שזה עתה הוכנו לטעון לתוך fluorometer microplate. אנו משתמשים מולקולרית התקנים Spectramax M3.
4. קראו היטב את כל אורכי הגל הבאים:

עירור (ננומטר)	פליטה (ננומטר)	ניתוק (ננומטר)
488	570	530
488	670	610
639	680	665

עוצמת nanosensor באורך גל זה תלוי בריכוז הנתרן. השימוש הגל תלוי היישומים. עבור איטי מדידות הדינמיקה תאיים, אנו משתמשים nm/570 488 ננומטר (עירור / פליטה) לבין 488 ננומטר nm/670 אשר מאפשרים לנו יחס שני אורכי גל להפחית את הרעש.

5. באופן מסורתי, optode נתונים מומר ערכים אשר הם: α = (אני - אני _{דק ')} / _{(מקסימום} אני - אני _דק'), שבו אני נמצא את עוצמת בריכוז הנתרן נתון, אני _דקות הוא בעוצמה הנמוכה ביותר המדידות תגובה ואני _{מקסימום} היא עוצמת הגבוה ביותר המדידות התגובה. המר או היחס בין עוצמת ב 570 ננומטר מחולק מעוצמת ב 670 nm או את עוצמת ב 680 ננומטר ל α.
6. השתמש בתוכנות מזימות, או Excel או מקור משמשים בדרך כלל במעבדה שלנו, לעלילה α לעומת יומן של ריכוז הנתרן, הגדרת יומן של ריכוז הנתרן אפס -1. Fit עקומת sigmoidal התגובה. מתוך העקומה, לחשב את ריכוז הנתרן ב α = 0.5 המייצג את הריכוז שבו החיישן מגיב בצורה אופטימלית.
7. התאם את יחס CHIII, NaIX ו NaTFPB ב optode כדי ליצור nanosensors עם תגובה אופטימלית סביב ריכוז נתרן של עניין.

4. תאיים הדמיה

1. עבור מדידות תאיים, nanosensors נעשים ברמת הגלוקוז מ"ג / 5 מ"ל במים microinjected לתוך התאים.
2. לגדול או העברת התאים בכלי זכוכית או תחתית תא הדמיה עם תחתית זכוכית coverslip.
3. דגירה התאים מדיה ברור או פתרון של Tyrode. הר קאמרית הדמיה או צלחת על מיקרוסקופ epifluorescence. אנו משתמשים LSM Zeiss 7 מיקרוסקופ confocal.
4. משוך נימי זכוכית עם חולץ פיפטה. אנו משתמשים סאטר בוערים חום p-97 עם 1 מ"מ OD, 0.78 מזהה זכוכית מ"מ, לקוטר טיפ אחרון סביב 300-500 ננומטר.
5. למילוי פיפטה עם פתרון nanosensor באמצעות מזרק ומחט המילטון, או מטעין microtip ו פיפטה.
6. הר פיפטה לתוך בעל המצורפת micromanipulator ומחובר מערכת הזרקה בלחץ מבוקר. כאן אנו משתמשים EXFO Burleigh PCS micromanipulator 6000 וכן מערכות רפואיות תאגיד מזרק.
7. מנמיכים את פיפטה על גבי התא, אל הציטופלסמה, לפעמים יש צורך "ברז" בעל מניפולטור לחדור את הממברנה. להזריק את הפתרון nanosensor ובמהירות למשוך את פיפטה.

5. הדמיה בשנת vivo

כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי טיפול בבעלי חיים באוניברסיטת Northeastern ועדת שימוש.

1. Nanosensorsעבור in vivo, הדמיה תאית מתקבלות פוספט שנאגרו מלוחים והותאמו להם מענה אופטימלי נתרן בריכוז הנתרן של mM 135.
2. עבור זריקה הגדרת הדמיה של nanosensors פלורסנט בעכברים, אנו משתמשים לומינה IVIS השניה יחידת ההרדמה הקשורים אליו. לחטא את אינדוקציה לתאי הדמיה. המקום CD1 עכברים בעירום (כ 20 גרם) בחדר אינדוקציה לחשוף אותם isoflurane. אחוז flowrate isoflurane וחמצן מנוהל ישתנו בהתאם למין ומשקל של עכברים. חכו העכברים להיות בהרדמה מלאה.
3. לאחר בעכברים מורדמים, להסיר את העכברים מהאולם אינדוקציה מקום החדרה הדמיה. שמור על עכברים תחת הרדמה. עבור כל עכבר, לחטא את האזורים הזרקת הרצוי.
4. ממלאים מזרק סטרילי אינסולין 31G עם 10 μL של nanosensors לוודא להסיר את כל בועות האוויר.
5. בעזרת מלקחיים, לתפוס קפל קטן של עור לאורך החלק האחורי של העכבר במקום ההזרקה הרצוי. בעוד לתפוס את העור, להוסיף את המזרק לתוך העור עם שפוע פונה כלפי מעלה ואת במקביל המחט לעור.
6. לפני הזרקת חיישנים, למשוך בחזרה על הבוכנה את המזרק על מנת להבטיח את המחט לא מוכנס לתוך כלי דם. ואז, בעדינות להזיז את המחט ימינה ושמאלה כדי ליצור כיס בתוך העור. זה יהיה למזער את הלחץ בחזרה הגורמת החיישנים לדלוף של הזריקה. להזריק את חיישנים להסיר בעדינות את המזרק.
7. בעדינות תפעילו לחץ על הזריקה וגם למחות כל פתרון שאולי דלפה של הזריקה. זה יהיה למזער את הקרינה מן חיישנים לא מוזרקים לתוך העור.
8. חזרה על שלבים 5.4 עד 5.7 עד מספר אזורי ההזרקה הרצוי הוא הגיע. שישה אתרים הזרקת מחולקת באופן שווה על הצד הימני והשמאלי של הגב מומלץ. עבור עכבר בנפרד, לשנות מחטים אם המחט הופכת קשה להכניס לתוך העור. מחטים לא אמור להיות משותף בין העכברים. זה יהיה למזער העברת מחלות או זיהום צולבות בין העכברים.
9. עבור דימות חיישנים נתרן ניאון, שאנו רוכשים הן brightfield ו פלורסנט תמונות של עכברים באמצעות מערכות הסינון מתאימים ביותר מקרוב את nm/680 640 ננומטר (עירור / פליטה) בספקטרום של nanosensors וכי גם למזער את autofluorescence של העור.

6. נציג תוצאות

באיור 1. עקומות התגובה של חמש קבוצות שונות nanosensor נתרן. קבוצה מייצגת nanosensors מ optode ניסוחים שונים שהיו באותה כמות של CHIII, NaTFPB, PVC ו-DOS, אך כמויות משתנות של NaIX. הנתונים הומרו ערכי α שימוש בעוצמות 639/680 ננומטר. הנתונים הם ממוצע של 3, ברים שגיאה מושמט לבהירות, עם עקומת sigmoidal מצויד באמצעות מקור. ב עקומת התגובה הזאת, את הריכוז המרבי של נתרן המשמש היה 500 מ"מ. Kd של nanosensors עבור נתרן נתרן נע בין 10 מ"מ (כתום יהלומים) של כ 150 מ"מ (ריבועים שחורים).

איור 2. הזריקה myocytes לב הילוד. היו תאים בתרבית על coverglass, רכוב על מיקרוסקופ מוזרק עם nanosensors נתרן. המוצגים הם פלורסנט (עירור 639 ננומטר), brightfield, ואת כיסוי. שים לב כמה אשכולות חיישן מתרחשת אבל יש מורפולוגיה תאים נורמליים, יש חיישנים מתפזרת ברחבי cytosol ואין העמסה גרעיני.

3. איור תת עורי הזרקה של עכברים עם nanosensors נתרן. תשע זריקות שונות של נתרן nanosensors נעשו לחלל תת עורית של עכברים בעירום. שניהם בשדה בהיר ותמונות ניאון (640/680) הם מעולף.

דיון

היווצרות nanosensors צריך לקחת לא יותר מ 10 דקות פעם הפתרון optode נעשה ואת השומנים PEG יבשים. Optode לא ניתן לבצע רק במהירות בעת הצורך, אך כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס, הם יכולים להיות יציבים במשך חודשים. הראינו כי nansensors, יצרו פעם אחת, הם יציבים בתמיסה במשך שבוע לפחות,. עם זאת, יש להקפיד על מנת למנוע photobleaching לאורך זמן זה על ידי חסימת nanosensors מן האור בעוד ⁶ nanosensors נתרן היו הפגינו כאן, optodes כבר יצרה עבור רוב ביולוגית יונים רלוונטיים כגון אשלגן כלוריד. ^10,12 הרחבנו גם את הטכנולוגיה הזו מולקולות קטנות, כגון גלוקוז ^13.

בנוסף להפקת nanosensors לפקח analytes שונים, nanosensors אלה ניתנים שינויים אחרים שיהפכו אותם שימושי ניסויים ביולוגיים ביותר. לדוגמה, ציפוי פני השטח, במקרה זה פולי (אתילן גליקול), יכול בקלות להיות שונה באמצעות כל מולקולה amphiphilic כי הוא מסיס במים. זה מאפשר את האפשרות של functionalizing אלו חלקיקים עבור יישומים או מטרות שונות. הגודל של חלקיקים יכולים גם להיות מותאם על ידי שינוי ציפוי פני השטח, את עוצמת sonication או ממס בשימוש.

האינדיקטורים סידן פלורסנט כבר לא יסולא בפז בקביעת סידן איתות תאיים, אולם לא צובעת נתרן זמין רגיש יש את המאפיינים אותו אידיאלי. Optode חלקיקים נועד לספק שיטה חלופית עבור יונים הדמיה intracellularly כבר בפיתוח במשך שנים. ¹⁴ בנינו על המחקר הקודם כדי ליצור nanosensors ספציפית עבור הדמיה נתרן תאיים כי יהיה בתקווה לספק אמצעי כדי להבין כיצד האותות נתרן משפיע על תפקוד הסלולר שינויים איתות הגורמות מחלות מסוימות.

השימוש nanosensors פלורסנט in vivo מציעה בזמן אמת חלופה מינימלית פולשנית עבור analytes ניטור על פני שיטות אחרות כגון דם שואבת. ³ נתרן ו גלוקוז nanosensors מבוסס על טכנולוגיה לעיל הוכחו לעקוב אחר שינויים נתרן גלוקוז, בהתאמה vivo. ^3,13 עם זאת, יש כיום קיימות מגבלות שיטה זו ככלי ניטור. לדוגמה, חיישנים חייב להכיל fluorophore עם ספקטרום עברה מספיק כדי למזער autofluorescence רקע מן העור. ¹⁵ שנית לכיוון אדום האינפרא אדום הקרוב, טכניקת ההזרקה הנוכחי אינו לייצר זריקה אחיד של nanosensors אשר עלולה להיגרם על ידי כך טעויות כמו וריאציה לעומק ההזרקה. למרות מגבלות אלה, הפיתוח של אלה nanosensors פלורסנט הפגנה מוצלחת שלהם יכול להפוך חיישנים אלה כלי המחקר שיטה שלא יסולא בפז עבור ניטור בריאות המטופל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם המוצר	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
IVIS לומינה II חבילת כלי	Caliper מדעי החיים	126273
CD-1 עכברים בעירום	צ'ארלס ריבר	קוד הזנים: 086	Immunodeficient
אינסולין מזרקים	BD	328438	3 / 10 סמ"ק מ"ל, 8mm, 31G
משקל מולקולרי גבוה PVC	סיגמא
DOS	סיגמא
CHIII	סיגמא
NaTFPB	סיגמא
NaIX	סיגמא
נימי זכוכית דקים חומה	סאטר
PEG השומנים	אוואנטי ליפידים פולאר