הכנת אורגנואידים מגידולים: מודל גידול תלת מבחנה תלת ממדי

הליכים בבעלי חיים המתוארים כאן בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במחלקה למשאבי חיות מעבדה, מרכז הסרטן המקיף רוזוול פארק, באפלו, ניו יורק.

הערה: עכברים זכרים שיש לנתח כדי לבודד ערמונית או גידולים בערמונית ליצירת אורגנואידים היו צריכים לפחות להגיע לגיל בגרות מינית - בערך 8-10 שבועות של גיל. גילאים ספציפיים של עכברים יכולים להשתנות בין מחקרים. כמה גורמים שיש לקחת בחשבון בעת בחירת גיל כוללים שינויים תלויי גיל באוכלוסיית תאי הערמונית, ביטוי תלוי גיל של טרנסגנים ספציפיים המונעים על ידי מקדם Cre, וקצב התקדמות הגידול בערמונית ב- GEMM מסוים.

הערה: איור 1 מציג תיאור ציורי של הליך יצירת אורגנואידים סרטניים.

1. הכנה

1. הכן מדיה אורגנואיד ערמונית עכבר על פי Drost et al. עם השינויים הבאים. השתמש בתווך מותנה במקום חלבונים רקומביננטיים עבור Noggin ו- R-Spondin והשתמש בריכוז סופי של 1% (v/v), במקום 10%, הן עבור Noggin- והן R-Spondin-conditioned medium.
   NOTE: תאי HEK293 הנגועים ביציבות בעכבר HA Noggin-Fc או עכבר HA Rspo1-Fc משמשים לייצור מדיום מותנה Noggin או R-Spondin, בהתאמה. קווי תאים אלה היו מתנה ממעבדת קלווין קאו באוניברסיטת סטנפורד.
2. הכן את תמיסת העיכול בצינור של 15 מ"ל על ידי דילול 20 מ"ג/מ"ל collagenase II עם מדיה מתקדמת DMEM/F12 (+++) לריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל. הוסף מעכב סלע Y-27632 לתמיסת collagenase II בריכוז סופי של 10 μM.
   NOTE: היחס בין חיץ העיכול לרקמה הוא 1 מ"ל ל -50 מ"ג, שבו אנו משתמשים על פי Drost et al.

2. טחינה ועיכול של רקמת הגידול

1. במכסה המנוע של תרבית התא, מניחים את רקמת הגידול בערמונית בצלחת תרבית סטרילית של 10 ס"מ, מנתחים ומשליכים רקמה נמקית.
2. טוחנים את רקמת הגידול הערמונית הנותרת לקוביות 1 מ"מ³ על ידי החזקת חלקי הרקמה עם המלקחיים המעוקלים הסטריליים וחיתוך במספריים לדיסקציה.
3. מניחים את חתיכות הגידול הטחון בצינור 15 מ"ל עם חיץ העיכול על ידי גריפה אותם עם הצד המעוגל של המלקחיים. לעכל את רקמת הגידול ב 37 ° C עם רעד במשך 1.5 עד 2 שעות. בדוק את התקדמות העיכול כל 20 דקות.
   NOTE: בשלב זה, להוציא לפחות 2 מ"ל של מטריצה מ -20 °C אחסון להפשיר על קרח. 1 מ"ל aliquots של מטריצה ייקח בערך 3 שעות כדי להפשיר.
4. לאחר עיכול רקמות, צינור צנטריפוגה ב 175 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C כדי ליצור גלולה התא.
5. הסר את supernatant, לסובב את הצינור כדי לשחרר את גלולת התא, ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של טריפסין שחומם מראש בתוספת 10 μM Y-27632 Rock Inhibitor. הכניסו את הצינור לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
6. לאחר הדגירה, פיפטה למעלה ולמטה 5 פעמים עם קצה P1000 סטנדרטי. החזר את הצינור לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות נוספות וחזור על שלב 2.6.
   NOTE: בשלב זה של ההליך, לחמם צלחת סטרילית של תרבית תאים 6 בארות על ידי הכנסתו לאינקובטור של 55 מעלות צלזיוס.

3. ספירת תאים והשעיה במטריצה

1. לשטוף את התאים על ידי הוספת 9 מ"ל של AdDMEM קר / F12 (+++) וצנטריפוגה את הצינור ב 175 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
2. לאחר הצנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט, הפוך את הצינור כדי לשחרר את הכדורית, ושטוף את התאים שוב על ידי הוספת 10 מ"ל של AdDMEM / F12 קר (+++). צנטריפוגה את הצינור ב 175 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
3. לאחר הצנטריפוגה, להסיר את supernatant, להעיף את הצינור כדי לשחרר את הכדור, להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של AdDMEM / F12 (+++), ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer על פי הליך סטנדרטי.
4. שבע עד שמונה כיפות מתאימות לבאר אחת של צלחת בת 6 בארות כאשר אורגנואידים מצופים במטריצה בצורה טיפתית. כ-200 מיקרוליטר מטריצה יפיקו 7-8 כיפות. להחליט כמה בארות של אורגנואידים דרושות למטרות ניסוי עתידיות ולחשב את נפח המטריצה הנדרשת. לאחר מכן, חשב את נפח התמיסה המכילה תאים הדרוש לריכוז סופי של 1.0 x 10⁶ תאים / מ"ל של מטריצה.
5. לאחר ספירת תאים, צנטריפוגה ב 175 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C. הסר את supernatant, להעיף את הצינור כדי לשחרר את הכדור, ולהשהות מחדש את התאים בנפח של מטריצה מחושב בשלב 3.4.
   NOTE: מטריצה נשאר בצורה נוזלית רק ב 4 °C (75 °F); שמור על צינורות מלאי מטריקס ותמיסות תאי מטריצה על הקרח בכל עת.

4. ציפוי כיפות מטריקס ויישום מדיה

1. ערבבו תמיסת תאי מטריצה עם פיפט P200 כדי לפזר את התאים באופן שווה מבלי להכניס בועות. מוציאים את צלחת התרבית בת 6 הבארות מאינקובטור 55 מעלות צלזיוס.
2. בזהירות פיפטה 200 μL של פתרון תא מטריצה במהירות לזרוק את הפתרון לתוך באר כדי ליצור כיפות.
3. חזור על שלב 4.2. עד להוצאת נפח תמיסת תא המטריצה. הניחו לכיפות להתמצק בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
4. הופכים את צלחת 6 הבארות ומכניסים את המנה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס להמשך התמצקות במשך 20 דקות.
5. לאחר הדגירה, להוסיף 2 מ"ל של מדיה אורגנואיד הערמונית עכבר לכל באר. הוסיפו אנדרוגן סינתטי R1881 לכל באר לקבלת ריכוז סופי של 1 ננומטר ומעכב סלע Y-27632 לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. ערבבו בזהירות והניחו את הצלחת באינקובטור של 37°C לתרבית.
   NOTE: יש להשלים מדיה לתרבית אורגנואידים עם מעכב סלע Y-27632 10 μM למשך שבוע אחד בלבד לאחר יצירת אורגנואידים.

איור 1: תרשים זרימה של הפרוטוקול ליצירת אורגנואידים של גידול בערמונית. לאחר ניתוח הגידול בערמונית, לטחון את הרקמה לחתיכות 1 מ"מ. לעכל את חתיכות הגידול ב collagenase, לאסוף את התאים, ולעכל טריפסין כדי לקבל תרחיף תא בודד. לאחר ספירת תאים, יש להשהות מחדש את נפח המטריצה הדרוש לריכוז תאים של 1.0 x 106 תאים/מ"ל. כיפות צלחת בצלחת בשיטת טיפה. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.