מיקוד ננו-חלקיקים פונקציונלי של סרטן השחלות: טכניקה להקל על ספיגת חומר ניגוד ננו-חלקיקים מצומדים בחומצה פולית על ידי תאי סרטן השחלות

תקציר

מקור: Lusk, J. F. et al. גילוי סרטן השחלות באמצעות ציטומטריית זרימה פוטואקוסטית. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקה המאפשרת הפנמה של ננו-חלקיקי נחושת גופרתית מכוסים חומצה פולית (CuS NPs). ל-CuS NPs הפונקציונליים על ידי חומצה פולית יש את היכולת להתמקד בקולטני חומצה פולית אשר באים לידי ביטוי יתר בתאי סרטן שחלות רבים.

פרוטוקול

1. סינתזת ננו-חלקיקים ופונקציונליזציה

זהירות: כל הסינתזה צריכה להתרחש במכסה אדים כימי מאוורר.

1. לפני הסינתזה, יש לסנן כ-300 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה (DI) דרך מסנן סטרילי בגודל 0.2 מיקרומטר.
2. נקו בקבוק תחתון עגול מזכוכית בנפח 250 מ"ל בתמיסת חומר ניקוי ושטפו במי DI. הוסף 0.0134 גרם של CuCl₂ לתוך 100 מ"ל של מים DI כדי ליצור פתרון 1 mM.
3. הוסיפו 0.015 גרם חומצה פולית (FA) לתמיסת CuCl₂ וערבבו במשך ~5 דקות באמצעות מוט ערבוב מגנטי.
4. הוסף Na₂S·9H₂O (0.024 גרם ב 100 μL DI מים) מעל כ -10 שניות לתערובת התגובה באמצעות פיפטה 200 μL.
   הערה: עם הוספת Na₂S·9H₂O, התמיסה תשנה את צבעה מצהוב בהיר לחום כהה.
5. מכסים את התגובה ומניחים באמבט שמן, מכוונים ל-90°C וממשיכים לערבב עם מוט ערבוב מגנטי. לאחר כ -15 דקות, או כאשר אמבט השמן הגיע 85-90 מעלות צלזיוס, לאפשר את התגובה להמשיך במשך שעה נוספת. התערובת שלך צריכה להפוך בהדרגה לצבע ירוק כהה.
   הערה: הקפידו לאוורר את המערכת בזמן חימום תערובת התגובה כדי למנוע הצטברות לחץ.
6. מוציאים את כלי התגובה מאמבט השמן ומצננים לזמן קצר בטמפרטורת החדר כ-10 עד 15 דקות לפני העברתם לאמבטיית קרח.
7. לאחר שתערובת התגובה התקררה מתחת ל-20°C, התאימו את ה-pH ל-10 תוך שימוש ב-1M NaOH כדי להמיס את החומצה הפולית הנותרת לתמיסה.
8. טהרו את תערובת התגובה FA-CuS באמצעות עמוד צנטריפוגה של 30 kDa. הוסף תמיסה באצוות של 15 מ"ל לעמוד ולצנטריפוגה במהירות של 3,082 x גרם למשך 15 דקות.
9. לאחר שכל תערובת התגובה מרוכזת, שלב מחדש את השברים המרוכזים ושטוף 4x עם 15 מ"ל של pH 10 NaOH בעמודת הצנטריפוגה של 30 kDa .
10. למדידות מסה, קח 1/3 מהתמיסה (~ 66 μL) ופצל לשלושה בקבוקוני זכוכית. יבש בתנור ואקום למשך הלילה ב 40 ° C תחת ואקום של ~ 27 מ"מ כספית.
11. יש להמיס את 2/3 התמיסה המרוכזת הנותרת לתוך 250 מיקרוליטר של PBS ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
12. לפני השימוש ב-FA-CuS NPs, סוניק אותם במשך 30 דקות בסוניקטור אמבטיה בסביבה גבוהה.

2. ספיגת NPs FA-CuS על ידי תאי סרטן השחלות

1. לפני הדגירה עם FA-CuS NPs, יש לדגור על תאי SKOV-3 בבקבוק T75 עם 8-15 מ"ל של מדיית RPMI-1640 נטולת חומצה פולית עם 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין למשך 24 שעות לפחות.
2. זרעו את התאים ב-0.5 מ"ל של RPMI-1640 ללא חומצה פולית במצע גידול שלם בצפיפות של 0.1 x 10⁶ תאים/מ"ל לתוך צלחת של 24 בארות.
3. למחרת, לדגור על התאים עם 400 מיקרוגרם / מ"ל FA-CuS NPS ב 0.5 מ"ל של RPMI-1640 ללא חומצה פולית מצע צמיחה מלא במשך 2 שעות.
4. בעקבות דגירה זו, טריפסינזציה של התאים עם 0.5 מ"ל של 0.25% טריפסין עם EDTA. הוסף לפחות 1 מ"ל של מצע גידול מלא ללא חומצה פולית RPMI-1640 כדי לנטרל את הטריפסין, וצנטריפוגה את התאים במהירות של 123 x גרם למשך 6 דקות.
5. הסר את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של PBS, צנטריפוגה ב 123 x גרם במשך 6 דקות. בצע את שלב השטיפה הזה 2x כדי להסיר NPs לא מאוגדים.
6. להשהות מחדש את התאים ב 1-2 מ"ל של PBS עם 2% תמיסת טווין.
7. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר וטריפאן כחול. יתר על כן, לדלל את התאים אם ספירת התאים גבוהה מדי. לדלל את התאים PBS עם 2% Tween לריכוז שנבחר לאיתור.
8. התאים מוכנים כעת לניתוח על ידי מערכת PAFC.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.025% טריפסין עם EDTA	קורנינג	25-053-CL
Amicon Ultra-15 מסננים צנטריפוגליים	מיליפור	UFC903024
Amicon Ultra-4 מסננים צנטריפוגליים	מיליפור	UFC803024
המטוציטומטר קו בהיר	האוזר סיינטיפיק	1492
נחושת(II) כלוריד	אקרוס אורגניקס	206532500
אמבט ניקוי אולטראסוני דיגיטלי מסדרת CPX	פישרברנד	דגם CPX3800
נורם-ג'קט 10 מ"ל מזרקים	הנקה סאס וולף	4100-X00V0
פ.ב.ס.	סיגמא-אולדריץ'	F2442-500ML
חומצה פולית	סיגמא-אולדריץ'	F7876-10G
PBS	אלפא עזר	J62036
פניצילין סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122
RPMI Midum 1640 (1x) ללא חומצה פולית	גיבקו	27016-021
תאי SKOV-3	ATCC	HTB-77
סודיום הידרוקסיד חרוזים	ב.ד.ה	BDH9292-500 גרם
נתרן גופרתי נונאהידראט	סיגמא-אולדריץ'	431648-50 גרם
טריפאן בלו סולושנס 0.4%	אמרסקו	K940-100ML
מסנן מזרק סטרילי 0.2 מיקרומטר	VWR	28145-477
אלקונוקס	סיגמא-אולדריץ'	242985-1.8 ק"ג	חומר ניקוי המשמש לניקוי כלי זכוכית.
טווין 20	סיגמא-אולדריץ'	P7949-100ML

.