$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. הכנת מיטוכונדריה מרקמות סרטן השחלות האנושי
דגימות רקמת שחלות כולל רקמות סרטן השחלות (n = 7) שימשו לפרוטוקול זה.
- הכן 250 מ"ל של מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי על ידי ערבוב 210 mM מניטול, 70 mM סוכרוז, 100 mM אשלגן כלורי (KCl), 50 mM Tris-HCl, 1 mM diamine tetraacetic acid (EDTA), 0.1 mM אתילן גליקול bis(2-aminoethyl אתר) חומצה טטראצטית (EGTA), 1 mM פנילמתאן sulfonyl fluoride (PMSF) מעכב פרוטאז, 2 mM נתרן אורתובנדאט (V), ו 0.2% אלבומין בסרום בקר (BSA), pH 7.4.
- מניחים ~ 1.5 גרם של רקמות סרטן השחלות בצלחת זכוכית נקייה.
- הוסיפו 2 מ"ל של מאגר הבידוד המיטוכונדריאלי המצונן מראש כדי לשטוף קלות את הדם מפני הרקמה 3x.
- השתמש מספריים עיניים נקיים כדי לטחון באופן מלא את הרקמה לתוך כ 1 מ"מ3 חתיכות, ולהעביר את הרקמות טחון לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
- הוסף 13.5 מ"ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי המכיל 0.2 מ"ג / מ"ל נגרסה, ולאחר מכן השתמש הומוגנייזר חשמלי כדי הומוגניזציה (השתמש בקנה מידה 2, 10 s 6x, מרווח 10 שניות) את הרקמות הטחונות (2 דקות, 4 ° C).
- הוסף עוד 3 מ"ל של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי לתוך הומוגנאטים של הרקמה ומערבבים אותם היטב על ידי pipetting.
- צנטריפוגה הרקמה המוכנה הומוגנט (1,300 x גרם, 10 דקות, 4 ° C). הסר את החלק הגרעיני הגולמי (כלומר, הכדור) ושמור על הסופרנטנט.
- צנטריפוגה את supernatant (10,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C). מוציאים את המיקרוזומים (כלומר, את הסופרנטנט) ושומרים את הכדור.
- הוסף 2 מ"ל של מאגר בידוד מיטוכונדריאלי והשהה מחדש את הגלולה היטב על ידי פיפטינג קל.
- צנטריפוגה את מתלה הגלולה (7,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C). השליכו את הסופרנאטנט ושמרו על המיטוכונדריה הגולמית (כלומר, הכדורית).
- הוסף 12 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות 25% (כלומר, Nycodenz) כדי להשהות מחדש את המיטוכונדריה הגולמי שחולץ.
- בצע שיפוע צפיפות לא רציף על ידי מילוי צינור מלמטה למעלה עם 5 מ"ל של 34%, 8 מ"ל של 30%, 12 מ"ל של 25% (המכיל את המיטוכונדריה הגולמי משלב 1.11), 8 מ"ל של 23%, ו -3 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות של 20%, וצנטריפוגה אותו (52,000 x גרם, 90 דקות, 4 ° C).
- השתמשו במזרק ארוך וקהה כדי לאסוף את המיטוכונדריה המטוהרים בממשק שבין מדיום שיפוע הצפיפות של 25% ו-30% לתוך צינור נקי.
- הוסיפו מאגר בידוד מיטוכונדריאלי למיטוכונדריה שנאספה כדי לדלל אותה לנפח של פי שלושה. צנטריפוגה (15,000 x גרם, 20 דקות, 4 מעלות צלזיוס) ולהשליך את הסופרנטנט.
- הוסף 2 מ"ל של חיץ בידוד מיטוכונדריאלי כדי להשהות מחדש את הגלולה והצנטריפוגה (15,000 x גרם, 20 דקות, 4 ° C). השליכו את הסופרנאטנט ושמרו את הכדור.
- אספו את הגלולה הסופית (כלומר, המיטוכונדריה המטוהרים) ואחסנו אותה בטמפרטורה של -20°C.
הערה: שלבו את כל המיטוכונדריה המטוהרים מרקמת סרטן השחלות כדגימת מיטוכונדריה לניתוח פרוטאומיקה כמותי.