כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. יצירת קו תאים VX2 במבחנה
- קצרו את הגידול VX2 משריר הארבע ראשי של הארנב והצמיחה בצלע העכבר.
- הפשירו קוביות גידול VX2 קפואות (1 ס"מ x 1 ס"מ), טחנו על צלחת תרבית באמצעות להב אזמל וסננו דרך מסנן של 70 מיקרומטר על ידי הוספת כמויות קטנות של תמיסת מלח מאוזנת Hanks (HBSS) ברצף כדי להבטיח שכל התאים מתוחים לנפח סופי של 1 מ"ל.
- יש לספור תאים ולדלל בתמיסת מלח חוצצת פוספט 0.9% לריכוז של 1 x 107/mL ולהניח על קרח בצינור סטרילי.
הערה: בלוקים סרטניים התקבלו ממשתף פעולה במעבדה מהתפשטות קודמת של גידולי VX2 בשרירי ארבע ראשי ארנב.
- מרדימים נקבת ארנבת ניו זילנדית לבנה (משקל 2.5-3.5 ק"ג) עם איזופלורן בשאיפה 2-5%, מסירים את הפרווה שמעל אתר ההזרקה ומנקים את אתר ההזרקה בתמיסת פובידון-יוד. הזריקו 500 μL של מתלה תאי VX2 מוכן (5 x 10,6 תאים/מ"ל) לתוך שריר הארבע ראשי של הארנב. עקוב קלינית אחר צמיחת הגידול בארנב החל מהיום העשירי.
- יש להרדים את הארנבים לאחר שהגידולים מגיעים לקוטר של 1-1.5 ס"מ (נמדד חיצונית באמצעות קליפרים) בשיטה המאושרת על ידי וטרינר. אשר המתת חסד על ידי בדיקת סימנים חיוניים, כולל קצב לב וקצב נשימה. הבלו את הגידול באמצעות מכשירים סטריליים לאחר ניקוי האזור עם תמיסת betadine.
- בארון בטיחות ביולוגי באמצעות מכשירים סטריליים, טוחנים את הגידול לחתיכות קטנות (0.2 ס"מ) על צלחת תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ באמצעות להב אזמל. העבירו את שברי הגידול דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר באמצעות 1 מ"ל HBSS כמתואר בשלב 1.1.1. לספור תאים ולדלל באמצעות תמיסת מלח 0.9% כדי לקבל 7.5 x 105 תאים ב 200 μL.
- מרדימים עכברי גמא NOD SCID זכרים (משקל 25 גרם) באמצעות 4% איזופלורן ב-1 ליטר/דקה ושומרים על הרדמה באמצעות 2% איזופלורן. לאחר הרדמת העכברים, יש להזריק 200 μL של התמיסה משלב 1.1.5 לרקמה התת עורית של אגף העכבר באמצעות מחט 27 מד.
- קציר והעברה של תאי VX2 במבחנה
- עקוב אחר צמיחת xenograft קלינית פעמיים בשבוע עד שהגידולים מגיעים לקוטר של 1 ס"מ באמצעות קליפרים.
- המתת חסד עכברים על ידי הנחת תא CO2 או ביצוע נקע צוואר הרחם לאחר הרדמה עם 4% גז איזופלורן. בלו גידולים בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגי.
- גידולים טחונים עם אזמל לחתיכות 1-2 מ"מ בצלחת תרבית רקמה בקוטר 6 ס"מ המכילה 3 מ"ל של מדיית נשר בינוני (DMEM)/Ham'ss F12+ 10% סרום בקר עוברי (FBS) של Dulbecco.
- השאירו את שברי הגידול ללא הפרעה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 למשך יומיים עד שהתאים יתחילו לצמוח מתוך חלקי הגידול. לאחר מכן, בדוק צלחות תרבית מדי יום על ידי מיקרוסקופ אור עבור מפגש תאים. עם הגעה למפגש של 70%, טריפסינזה תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של 0.05% טריפסין לבקבוק והחזרה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- נטרל טריפסין עם 6 מ"ל של DMEM/Ham's's F12 + 10% FBS בינוני, לאסוף תאים וצנטריפוגה ב 4 ° C במשך 5 דקות ב 300 x גרם. הסר את גלולת supernatant והשהה מחדש ב- 3.5 מ"ל של מדיה חדשה מסוג DMEM/Ham's F12 + 10% FBS. זרעים טריים קולגן 6 ס"מ צלחות מצופות I עם 1.6 x 106 תאים לצלחת כדי להשיג כ 50% צפיפות זריעת תאים.
הערה: צפיפות תאים של 50% מתייחסת לתאים התופסים 50% משטח הפנים של הצלחת כאשר הם מחוברים.
- מעבר מוקדם: חזור על התהליך לעיל (טריפסיניזציה, זריעה) עד שהתאים עברו 5 פעמים ולאחר מכן להעריך את טוהר קו התא עם PCR באמצעות בדיקת PCR כמותית כדי להבחין בין DNA גנומי ארנב לדנ"א גנומי של עכבר (ראה שלב 1.3.1-1.3.4).
הערה: לאחר 8 מעברים, ניתן להפיץ תאים על לוחות תרבית רקמה רגילים שאינם מצופים קולגן.
- מעבר, טריפסיניזציה והקפאה של aliquots של תאים DMEM/HAM F12+30% FBS+10%DMSO בריכוז של 2 x 106 לכל בקבוקון. אחסנו תאים בחנקן נוזלי עד שיידרש לניסויים.
- אישור מקור VX2 של תאים ששרדו:
- צור תרופה סטנדרטית מדנ"א גנומי מטוהר של עכבר וארנב (שלב 1.3.2 ושלב 1.3.3). השתמש בפריימרים המכוונים לרצפים ספציפיים למין בתוך מסגרת הקריאה הפתוחה השנייה של רכיב הרטרוטרנספוזון LINE-1.
הערה: רצפי פריימר עבור CRPV E6 הם: 5's- GATCCTGGACCCAACCAGTG ו- 5's-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. נעשה שימוש ברכיבי רטרוטרנספוזון LINE-1. רצפי פריימר עבור ארנב LINE-1 הם: 5's-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC ו- 5's-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT רצפי פריימר עבור עכבר LINE-1 הם: 5's-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG ו- 5's-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
- כדי ליצור עקומה סטנדרטית עבור CRPV E6, טהרו את הליזט של תאי הגידול VX2 (שלב 1.1.1) באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן. כמת את הדנ"א הזה באמצעות בדיקה מסחרית. בצע 6 דילולים טוריים מ- 225 pg/μL עד 0.925 pg/μL במאגר EDTA-TE נמוך. כדי ליצור עקומה סטנדרטית לדנ"א גנומי של עכברים, דללו 100 מיקרוגרם של דנ"א גנומי מסחרי של עכבר במאגר EDTA-TE נמוך ב-5 דילולים מ-125 pg/μL עד 0.0125 pg/μL.
- מניחים 4 μL מכל תמיסה מדוללת מהדגימות משלב 1.3.2 בבארות ומריצים דגימות בתרמוסייקלר PCR. השתמש בערכי Cq מכל ריצה יחד עם כמויות ה- DNA לכל באר כדי לחשב עקומה סטנדרטית באמצעות הגדרות הסף האוטומטי של תוכנת thermocycler.
- השתמש בהליכי qPCR סטנדרטיים לביצוע PCR עם 40 מחזורים של מחזור דו-שלבי (98 ° C ו- 60 ° C) על thermocycler. קבע ערכי סף והגדר ערכי Delta Ct על >35 כדי להבטיח זיהום עכבר מינימלי בקו תאי VX2 של ארנב. הנפח הכולל של כל תגובה היה 10 μL, המורכב מ-5 μL של 2x Mastermix, 1 μL של פריימרים קדמיים + הפוכים עם ריכוז פריימר סופי בתגובה ב-250 ננומטר, ו-4 μL של דגימת DNA.
הערה: ערכי סף נקבעים, וערכי Delta Ct נקבעים על >35 כדי להבטיח זיהום עכבר מינימלי בקו תאי VX2 ארנב. הרמה המומלצת של VX2 DNA לזיהוי אמין על ידי qPCR היא 1-10 pg.
2. תרבית תאי VX2 ויצירת תרחיף תאים
- הפשירו בקבוקונים המכילים תאי VX2 (מוקפאים בשלב 1.2.7) באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך דקה אחת והעבירו תאים לצינור צנטריפוגה חרוטי עם 10 מ"ל של מדיום תרבית (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין). צנטריפוגה למשך 8 דקות ב 107 x גרם, להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את כדור התא ב 9 מ"ל של מדיה.
- מעבירים תאים מרחפים מחדש לצלוחית תרבית גדולה. יש לדגור על תאים ללא רעידות בטמפרטורה של 37°C. לבדוק תאים מדי יום עבור מפגש באמצעות מיקרוסקופ אור ולשנות מדיה תרבית כל שלושה ימים.
- יצירת תרחיף תאי VX2 בתרבית להזרקה
- טריפסיניזציה של תאים על ידי הוספת 3 מ"ל של 0.25% טריפסין לבקבוק ברגע שהתאים הגיעו למפגש של 80%. מניחים את הבקבוק באינקובטור (37°C) למשך 5 דקות. מעבירים תמיסה לצינור צנטריפוגה חרוטי וצנטריפוגה למשך 8 דקות במהירות של 107 x גרם ולאחר מכן מסירים סופרנטנט.
- לשטוף את כדורי התא 3 פעמים עם 9 מ"ל של פוספט חוצץ מלוחים, צנטריפוגה ולהסיר supernatant כאמור לעיל. לספור את התאים ולדלל עם תמיסת מלח חוצצת פוספט 0.9% לריכוז של 4 x 107 תאים / מ"ל ומניחים בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי על קרח.
- יצירת תרחיף תאי VX2 מופץ in vivo להזרקה
- הפשירו בלוקים סרטניים קפואים מסוג VX2 (1 ס"מ x 1 ס"מ), טחנו על צלחת תרבית באמצעות להב אזמל וסננו דרך מסנן של 70 מיקרומטר כמו בשלב 1.1.1. הוסף כמויות קטנות של HBSS ברצף כדי להבטיח שכל התאים מתוחים לנפח סופי של 1 מ"ל. לספור תאים ולדלל עם 0.9% פוספט מלח חוצץ לריכוז של 1 x107/mL ומניחים על קרח בצינור סטרילי.
הערה: בלוקים סרטניים התקבלו ממשתף פעולה במעבדה מהתפשטות קודמת של גידולי VX2 בשרירי ארבע ראשי ארנב.
3. הקמת מודל כירורגי
- הקמת הרדמה כירורגית והכנה טרום ניתוחית
- טרום תרופות ארנבות לבנות בניו זילנד (2.5-3.5 ק"ג) 1 שעה לפני ההליך הכירורגי המתוכנן באמצעות זריקות של acepromazine (1 מ"ג / ק"ג IM) ו meloxicam (0.2 מ"ג / ק"ג SQ). להרדים נקבת ארנבת ניו זילנדית לבנה (משקל 2.5-3.5 ק"ג) עם 2-5% איזופלורן בשאיפה, להסיר את הפרווה מעל אתר ההזרקה ולנקות את אתר ההזרקה עם תמיסת פובידון-יוד.
- ארנבים מורדמים באינטובציה באמצעות מסכת גרון (LMA) ומאובטחים במקומם עם נייר דבק, תוך שמירה על הרדמה עמוקה על ידי טיהור מינון איזופלורן בשאיפה בין 2-5%. עקוב אחר הרדמה כירורגית באופן קבוע לאורך כל ההליך על ידי בדיקת סימנים חיוניים (קצב נשימה, מילוי נימי, ריווי חמצן אם זמין) וניטור סימנים המרמזים על כאב (תנועה, נסיגה מגירויים, רעשים) או הרדמה קלה (תנועה, לעיסה של צינור LMA).
הערה: זה צריך להיעשות על ידי מישהו עם ניסיון ניטור הרדמה כירורגית.
- יש לשים קטטר ווריד אוזניים בעל 22 מד בווריד הגבי השולי. יש לתת cefazolin (20 מ"ג / ק"ג) תוך ורידי 10 דקות לפני חתך העור הניתוח.
- קצצו שיער על האגן והבטן לפני הנחת הארנב על שולחן הניתוחים, ולאחר מכן הניחו את הארנבים במצב גבי על שולחן הניתוחים. נקו את שדה הניתוח באמצעות הכנה כירורגית לעור בשלושה שלבים (סבון בטדין, תמיסת כלורהקסידין, תמיסת בטאדין). יש לעטוף את שדה הניתוח בווילונות לפרטומיים לאחר סימון הקרקע של החלק העליון של עצם הערווה, תוך השארת אזור בגודל 5X5 ס"מ של הבטן התחתונה חשוף.
- יצירת חתך לפרוטומי וזיהוי קרני הרחם
- חבשו כובע כירורגי ומסכת פנים. יש לשפשף ידיים באמצעות תמיסת פילינג כירורגית כלורהקסידין או בטאדין. בטכניקה סטרילית, לבשו חלוק סטרילי וכפפות כירורגיות סטריליות.
- באמצעות אזמל # 11 להבים, לבצע חתך באורך 2.5 ס"מ 1 ס"מ גולגולת לסימפיזיס pubis דרך העור ורקמה תת עורית של בטן הארנב. חותכים את פי הטבעת ומנתחים את שרירי הרקטוס לרוחב כדי לחשוף את הצפק הבסיסי. הזן את הצפק בחדות לאחר וידוא כי מתחת לפני השטח נקי מעי או איברי בטן אחרים.
- לאתר את קרני הרחם המזהות את שלפוחית השתן ולטאטא אצבע בכפפה בצורה עליונה, אחורית וצידית על קודקוד שלפוחית השתן.
הערה: במידת הצורך, ניתן לרוקן את שלפוחית השתן המלאה באמצעות לחץ דיגיטלי. לאחר האיתור, הביאו את קרני הרחם דרך חתך הבטן לנוח על דופן הבטן.
- באמצעות תפר 3-0 קלוע נספג, לבצע קשירת תפר בודדת של כל קרן רחם כ 1.5-2.0 ס"מ דיסטלי לצוואר הרחם. הניחו את התפר רק מדיאלי לעורקי הרחם, אשר עוברים לאורך האספקט הצידי של כל קרן. קשרו את התפרים היטב כדי לחסום את קרני הרחם הדיסטליות (איור 1).
- חיסון מיומטריאלי VX2
- באמצעות מחט של 27 מד, הזריקו 0.5 מ"ל של מתלה תאי VX2 שהוכן קודם לכן משלב 2.3.2 (עבור מודל VX2 בתרבית) או 2.4 (עבור מודל VX2 מופץ in vivo) לתוך המיאומטריום של כל קרן רחם פרוקסימלית לאתר התפר (בין אתר התפר לצוואר הרחם). יש להזריק מעל דקה אחת ולוודא שהתאים אינם מוזרקים לחלל הרחם שמתחתיו. מרדימים בעלי חיים באמצעות איזופלורן בשאיפה (2-5%) ומכונת הרדמה עם מעגל ביין.
- יש להפעיל לחץ על אתר ההזרקה של המומימטריום למשך 30 שניות לאחר ההזרקה כדי למזער את דליפת התאים. בדוק את אתרי ההזרקה והתפר עבור hemostasis והחזיר את קרני הרחם לתוך הבטן.
- סגירת החתך הניתוחי
- סגירת דופן בטן עמוקה: זיהוי קודקוד החתך הצפק ואחיזת הצפק, שריר הרקטוס והפאשיה בעזרת מלקחיים רקמתיים.
- לשם כך, יש לעגן את התפר בקודקוד אחד של החתך על ידי תפירה שטחית לעמוקה בצד אחד של החתך ועמוקה לשטחית בצד השני. לקשור קשר. באמצעות התפר המחובר, יש לבצע תפרים רצים בניצב לחתך דרך שכבות דופן הבטן הפועלות לאורך החתך מצד לצד. קושרים את התפר וחותכים.
- סגירת דופן בטן שטחית: יש לזהות את קודקוד החתך בעור ולתפור את עור הבטן באמצעות תפר פולי-פילמנטי תת-עורי 3-0 נספג. יש למרוח דבק כירורגי על החתך הסגור כנגד קצוות העור.
- לשם כך, יש לעגן את התפר בקודקוד אחד של החתך, על ידי תפירה עמוקה עד שטחית בצד אחד של החתך ושטחית עד עמוקה בצד השני. לקשור קשר. באמצעות התפרים המחוברים, יש לבצע תפרים רצים בשכבת העור במקביל לחתך הפועלים בצעד לאורך החתך מצד לצד. קושרים את התפר וחותכים.
- טיפול לאחר הניתוח
- התעוררות מהרדמה: כבו את האיזופלורן ברגע שהחתך נסגר ותנו לארנב לנשום חמצן באמצעות מסכה תוך כדי מעקב אחר סימני התעוררות (למשל, תנועות ספונטניות, פתיחת עיניים ותנועות לעיסה בנתיב האוויר של מסכת הגרון). הוציאו את הארנב ברגע שסימנים אלה נרשמים וספקו חמצן על ידי מסכה ושמיכה חמה עד שהארנבים ערניים ומסוגלים לשבת באופן עצמאי.
- ניטור לאחר הניתוח: עקוב אחר ארנבים פעמיים ביום במשך 4 ימים ומדי יום במשך 10 ימים נוספים לאחר הניתוח. כדי לעקוב, להעריך את מצבם הכללי, צריכת המזון והמים שלהם, תפוקת השתן והצואה, הערכת כאב, משקל, סימנים חיוניים (קצב לב, קצב נשימה) ואת האתר הכירורגי שלהם מחפש נפיחות, אריתמה, פריקה או לחישה.
- שליטה בכאב לאחר הניתוח: יש לתת Meloxicam מדי יום (0.2 מ"ג/ק"ג מ"ר) במשך 48 שעות לאחר הניתוח ולאחר מכן לפי הצורך בהתבסס על הערכת כאב. יש לתת בופרנורפין מיד לאחר הניתוח וכל 12 שעות (0.01-0.05 מ"ג/ק"ג מ"ר) למשך 24 שעות ולאחר מכן לפי הצורך בהתבסס על הערכת כאב
- אנטיביוטיקה (אנרופלוקסצין 5 מ"ג / ק"ג IM) עשויה להינתן מדי יום במשך שבעה ימים לאחר הניתוח כדי למנוע זיהום בפצע כפי שהומלץ על ידי הווטרינר שלך. מתן נוזלים תת עוריים (15 מ"ל של SQ) פעמיים ביום לפי הצורך להתייבשות, ומזונות רכים או תוספי תזונה אחרים מסופקים מדי יום לפי הצורך לירידה במשקל.
