מידול תקשורת סרטן השחלות לצורך הדמיה ניתוח ספקטרומטריית מסות: שיטה לזיהוי מתקשרים כימיים של מולקולות קטנות בהתפתחות גידול שחלות גרורתי

תקציר

מקור: Zink, K. E. et. al. לכידת תקשורת מולקולות קטנות בין רקמות לתאים באמצעות ספקטרומטריית מסות הדמיה. J. Vis. Exp. (2019)

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להכנת דגימות על ידי תרבית משותפת של צמחי שחלה עם תאי סרטן החצוצרה. דגימות אלה מוצגות באמצעות ספקטרוסקופיית מסות הדמיה, או IMS, כדי לזהות חילופי מולקולות קטנות בין התאים והרקמות המובילים להתפתחות הגידול.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הקמה ודגירת המגלשה המטופלת ב- ITO עבור Cocultures

1. תרבויות משותפות בלתי מחולקות
   1. נזלו את האגרוז ב 70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה.
   2. הניחו את המחיצה בעלת 8 הקידוחים על גבי שקופית המטופלת בתחמוצת האינדיום (ITO) (איור 1A). תחתית הגומי על המחיצה מסייעת בהידבקות למגלשה, אך יש להקפיד להפעיל לחץ עדין מתמשך כלפי מטה במהלך ציפוי האגרוז כדי להבטיח שלא תהיה דליפה או ערבוב בין הבארות.
   3. לאסוף תאים בצינור חרוטי 15 מ"ל, צנטריפוגה (5 דקות ב 800 סל"ד), ולהשהות מחדש ל 50k תאים לכל 150 μL במדיה 1x DMEM. אם צפיפות תאים שונה היא אופטימלית, ודא כי בשלב זה תרחיף התא הוא פי 2 מהצפיפות הסופית הרצויה (למשל, עבור ריכוז סופי של 50,000 תאים ב 300 μL, צפיפות התא בשלב זה היא 50,000 תאים ב 150 μL).
   4. לפני ציפוי תרבית תאים, הוסיפו חציל שחלות למרכז הבאר (איור 1B).
   5. הוסיפו אגרוז לכל תרבית תאים בצינורות בודדים של 2 מ"ל ממש לפני הציפוי. עבור כל באר, לשלב 200 μL של תרחיף התא ו 200 μL של agarose נוזלי בצינור 2 מ"ל. לדוגמה, עבור ארבע בארות, לשלב 800 μL של תרחיף התא ו 800 μL של 2% agarose. חלק מהתערובת תישאר אך הכנת מעט יותר מהנדרש מונעת בועות אוויר במהלך הפיפט.
      1. הוסיפו אגרוז לתרביות תאים בודדות מיד לפני ציפוי תרבית התא. האגרוז יתקרר תוך פחות מדקה, אז היו מוכנים לצלחת במהירות.
   6. הוסיפו מיד 300 מיקרוליטר של תערובת התא/אגרוז לכל באר (איור 1C). איור 1C מראה שלושה תנאי תאים ותנאי מדיה אחד, שכל אחד מהם מצופה עם ובלי שחלה.
   7. יש לדגור על מגלשה בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO₂ באינקובטור לח.
2. תרבויות מפוצלות
   1. חתכו חוצצים מפלסטיק דק וחלק (איור 2A).
      הערה: ניסוי זה משתמש בדפנות של אגן מדיה חד פעמי סטרילי מכיוון שהם שטוחים ודקים. חותכים אותם מספיק רחב כדי להתאים בנוחות לתוך hypotenuse של הבאר (~ 13 מ"מ).
   2. נזלו את האגרוז ב 70 מעלות צלזיוס על צלחת חמה.
   3. הניחו את המחיצה בעלת 8 הבארות על גבי המגלשה שטופלה ב-ITO (איור 2B). תחתית הגומי על המחיצה מסייעת בהידבקות למגלשה, אך יש להקפיד להפעיל לחץ עדין מתמשך כלפי מטה במהלך ציפוי האגרוז כדי להבטיח שלא תהיה דליפה או ערבוב בין הבארות.

2. ייבוש שקופית והכנה ל-MALDI-TOF MS

1. לאחר ארבעה ימים (או כל נקודת זמן מועדפת), הסירו את מחיצת התא מתקעי האגרוז ומהמגלשה (איור 1D). נתקו בעדינות את דפנות האגרוז מהחדר בעזרת מרית שטוחה ומשכו בעדינות את החדר כלפי מעלה, תוך זהירות שלא להזיז תקעי אגרוז. אם הם זזים, מקמו אותם מחדש בעדינות כך שהם לא ייגעו זה בזה.
2. מכניסים את המגלשה לתנור בטמפרטורה של 37°C למשך כ-4 שעות, ומסתובבים ב-90° בכל שעה.
   הערה: סיבוב השקף חשוב כדי להבטיח פיזור חום אחיד לאורך הדגימה.
3. לאחר הייבוש, הסירו את המגלשה מהתנור (איור 1E).
4. החל תמיסת מטריצה באמצעות המרסס (איור 1F), עם הפרמטרים הבאים: טמפרטורה = 30 ° C, קצב זרימה = 0.2 מ"ל / דקה, מספר מעברים = 8, כיוון = CC, ומרחק זרבובית = 40 mm.
   הערה: במקום מרסס מטריצה, ניתן להשתמש במברשת אוויר אמנותית ליישום מטריצה נוזלית. ניתן להשתמש באותה תמיסת מטריצה לריסוס, אך נדרשת בערך כמות כפולה של תמיסה. כאשר המגלשה מהודקת כך שהיא תלויה אנכית, רססו את המגלשה מזווית של 90° במרחק של כמטר אחד עד ששכבת המטריצה תהיה גלויה.
5. הוסף 1 μL של calibrant (אדום זרחן עבור מטרות <500 Da, תערובת פפטיד (ראה טבלת חומרים) עבור מטרות <5,000 Da) כדי לנקות נקודות בשקופית. אדום זרחן אינו דורש ערבוב עם המטריצה, אך תערובת הפפטיד דורשת תערובת של 1:1 עם המטריצה כדי לסייע ליינון. המתינו עד שהכיול יתייבש.
6. צייר X באמצעות סמן קבוע בכל פינה של השקופית וצלם תמונה אופטית באמצעות מצלמה או סורק ברזולוציה של 1,200 dpi.

תוצאות

איור 1: זרימת עבודה להכנת דוגמאות של תרבות משותפת בלתי מחולקת. (A) יש להדביק את התא בעל 8 הקידוחים לצד המוליך של שקופית מצופה ITO. (B) להניח שחלות חצויות במרכז בארות לתנאי חקלאות משותפת. (C) הוסף 300 μL של תרחיף אגרוז/תא ישירות לבארות. יש לוודא שאין בועות אוויר ושהשחלה נשארת במרכז הבאר. אם האגרוז החזירי הפריע לשחלה, השתמשו בעדינות בקצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דנוויל	C1017-O	כדי לאסוף תאים
מיליפור	PEZGS0816	שונה מ- Millipore Millicell שקופית תא שקופיות EZ
סיגמא-אולדריץ'	34998-4L	ממס למטריצה מרוססת
אפנדורף	1850 ₪	כדי לאסוף תאים ולהסיר סופרנאטנט
ברוקר דלטוניק	8201344	מטריקס מרוסס על מגלשה מיובשת
ברוקר דלטוניק	8201346	מטריקס מרוסס על מגלשה מיובשת
גיבקו	11995-065	מדיה מעורבת באגרוז
ג'נסי סיינטיפיק	22-282	עבור aliquots agarose
ברוקר	8237001	פלטפורמה לדגירת תרבות משותפת
סיגמא-אולדריץ'	A9414-10G	מעורבב עם מדיה לציפוי
קורנינג	4870	משמש לחיתוך מחיצות פלסטיק עבור חדרים מחולקים
ברוקר דלטוניק	8206195	כיול לטווח מסה בינוני
סיגמא-אולדריץ'	343-242-5G	כיול לטווח מסה נמוך
סימגה אולדריץ'	E2758	מוסף מדיה לתרבית תאים
Peprotech Inc.	100-15	מוסף מדיה לתרבית תאים
סלגרו	30-005-CR	מוסף מדיה לתרבית תאים
סיגמא-אולדריץ'	11074547001	מוסף מדיה לתרבית תאים
גיבקו	25030-081	מוסף מדיה לתרבית תאים
גיבקו	15140-122	מוסף מדיה לתרבית תאים
פישר טכנולוגיות	A116-50	נוסף לפתרון מטריצה
HTX טכנולוגיות		להחלת מטריצה