$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. סינתזת ליבת ננוסטאר זהב
הערה: ננו-כוכבי זהב משמשים כליבות לשני הטעמים של ננו-גשושיות SERRS המשמשות בניסוי זה.
- הכן 800 מ"ל של תמיסת חומצה אסקורבית 60 מ"מ (C6H8O6) במים דה-יוניים (DI) ו-8 מ"ל של תמיסת חומצה טטרכלורואורית (HAuCl 4) של 20 מ"ל במי DI. מצננים ל-4°C.
- בצע שלב תגובה זה ב 4 °C. הניחו בקבוק חרוטי המכיל 800 מ"ל של תמיסת חומצה אסקורבית על צלחת ערבוב מגנטית וגרמו למערבולת יציבה. הוסף במהירות 8 מ"ל של תמיסת חומצה טטרכלורואורית למערבולת. תוך שניות ייווצרו ננו-כוכבים והפתרון יקבל צבע כחול כהה. אם הצבע בכל עת הופך ורוד או סגול, המסמל את היווצרות ננוספירות, יש להשליך את ההשעיה ולנסות מחדש את הסינתזה.
- יוצקים את מתלה הננו-כוכב לתוך צינורות חרוטיים 50 מ"ל וצנטריפוגה למשך 20 דקות (4°C, 3,220 x g). שואפים את הסופרנאטנט ומשאירים כ-200 מיקרוליטר של התמיסה בכל צינור. היזהר שלא להפריע לגלולת הננו-חלקיקים בתחתית הצינור.
הערה: לסופרנאטנט צריך להיות גוון כחול בגלל הננו-כוכבים המרחפים הנותרים.
- באמצעות מיקרופיפטה, לעורר את התמיסה כדי להשהות ולאסוף את החלקיקים מכל צינור. חלק מהגלולה עשוי להידחס בתחתית הצינור ולא יהיה תלוי מחדש אפילו עם פיפטינג נמרץ – יש להשליך חלק זה.
- מעבירים את תרחיף הננו-חלקיקים לקסטת דיאליזה (MWCO 3.5 kDa) ומבצעים דיאליזה לפחות שלושה ימים כנגד 2 ליטר מים DI, תוך החלפת המים מדי יום. אחסנו ננו-כוכבים בדיאליזה בטמפרטורה של 4°C למשך עד חודש עם החלפת מים כל 3-4 ימים.
הערה: יש לשמור את הננו-כוכבים בדיאליזה עד שיידרש לתגובת הסיליקציה, כמתואר בסעיף 2.
2. היווצרות מעטפת הסיליקה
הערה: שני טעמים של ננו-גשושיות ראמאן מסונתזים. הליך הסינתזה זהה עבור שניהם, כאשר ההבדל היחיד הוא מולקולת כתב ראמאן (צבע) בשימוש. בניסוי זה נעשה שימוש בפרכלורט IR780 וב-IR140. התגובה צריכה להתבצע תמיד במיכלי פלסטיק. הסינתזה ניתנת להרחבה גבוהה וניתן להתאים אותה לכמות ההזרקה הרצויה הנדרשת. כאן מתוארת סינתזת אצווה בינונית, שניתן לשנות את קנה המידה שלה באופן ליניארי לנפחים נמוכים או גבוהים יותר לפי הצורך, עם אותם ריכוזים וזמני תגובה. התגובות לשני סוגי הננו-גשושיות SERRS יכולות להתבצע במקביל. שימו לב כדי למנוע זיהום צולב. סוניקציה צריכה להתבצע לפיזור מחדש של כדורי ננו-חלקיקים לאחר צנטריפוגה במהלך שלבי שטיפה או לאחר שהננו-חלקיקים אוחסנו במשך יותר משעה. סוניקציה צריכה להתבצע עד שהננו-חלקיקים מרחפים בבירור לתוך התמיסה, בדרך כלל למשך שנייה אחת.
- בצינור A (צינור חרוטי של 50 מ"ל), מערבבים 10 מ"ל של איזופרופנול, 500 מיקרוליטר של TEOS, 200 מיקרוליטר של מי DI ו-60 מיקרוליטר של צבע (IR780 פרכלורט או IR140, 20 מילימטר ב-DMF (דימתילפורממיד)).
- בצינור B (צינור חרוטי של 15 מ"ל), מערבבים 3 מ"ל אתנול ו-200 מיקרוליטר אמוניום הידרוקסיד. סוניק את הננו-כוכבים משלב 1.4 כדי לפזר את כל הצבירים בתמיסה ולהוסיף 1.2 מ"ל של ננו-כוכבים לצינור.
הערה: תמיסת האמוניום הידרוקסיד נדיפה מאוד וקשה לפיפטה מדויקת. יש לאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C, עד לצורך, כדי להקל על הפיפט.
- מניחים את צינור A על מערבל מערבולת ויוצרים מערבולת יציבה. הוסיפו במהירות את תכולת צינור B למערבולת והמשיכו לערבב במשך כ-5 שניות. מעבירים מיד לשייקר ומאפשרים לו להגיב במשך 15 דקות תוך כדי רעד ב-300 סל"ד, בטמפרטורת החדר.
- לאחר הדגירה של 15 דקות, להרוות את התגובה על ידי הוספת אתנול כדי למלא את הצינור 50 מ"ל. צנטריפוגה למשך 20 דקות ב- 3,220 x גרם ו- 4 ° C.
- שואפים את supernatant, משאיר על 0.5 מ"ל של פתרון, נזהר לא להפריע את הכדור. מוסיפים 1 מ"ל אתנול ומתסיסים עם פיפטה כדי להשעות מחדש את הננו-חלקיקים. מעבירים לצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל ושוטפים 4 פעמים באתנול על ידי צנטריפוגה במינון 11,000 x גרם למשך 4 דקות, תוך שאיפת הסופרנטנט והשעיית הגלולה על ידי אולטרסוניקציה למשך שנייה אחת בערך.
- הערה: בשלב זה, ניתן לתפקד את הננו-חלקיקים הסיליקטיים, כמתואר בסעיף 3, או להשהות אותם מחדש במי DI עם שלב שטיפה נוסף, לאחסון בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
3. פונקציונליות פני השטח
הערה: ננו-גשושיות IR780 SERRS יצומדו עם נוגדנים מכווני קולטן פולאט באמצעות קרוסלינקר PEG ליצירת αFR-NPs; ננו-גשושיות הבקרה IR140 SERRS יצומדו לחד-שכבה פסיבית מסוג PEG, עבור nt-NPs. שני הטעמים נוצרים באמצעות תגובת תיול-מלימיד בתגובות נפרדות אך מקבילות.
- שטפו ננו-חלקיקים פעמיים על ידי צנטריפוגה במהירות של 11,000 x גרם במשך 4 דקות, שאפו את הסופר-נטנט, והשעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל אתנול על ידי אולטרסוניקציה. חזור על שלב השטיפה פעם נוספת, אך התפזר מחדש ב 1 מ"ל של 85% אתנול, 10% 3-MPTMS (3-mercaptopropyltrimethoxysilane), ו 5% מים DI. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות כדי להכניס תיולים על פני השטח של החלקיקים.
- שטפו את הננו-חלקיקים הפונקציונליים בתיול על ידי צנטריפוגה של 11,000 x גרם במשך 4 דקות, שאיפת הסופרנאטנט והשעיית הגלולה מחדש על ידי אולטרה-סוניקציה, פעמיים באתנול, פעמיים ב-DI, ולבסוף בחיץ HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) (10 mM, pH 7.1), והניחו בצד.
- הערה: יש להשתמש במאגר MES (2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid) או HEPES. מאגרים בעלי מליחות גבוהה יותר, כגון PBS (מלוחים חוצצי פוספט), עשויים לגרום לצבירת ננו-חלקיקים.
- עבור αFR-NPs המתפקדים כנוגדנים, יש להגיב ב-200 מיקרוגרם נוגדנים (שיבוט נוגדנים חלבוני קושר אנטי-פולאט [LK26]) עם עודף מולארי פי עשרה של PEG crosslinker (poly(ethylene glycol)(N-hydroxysuccinimide 5-pentanoate) ether N′-(3-maleimidopropionyl) aminoethane (CAS: 851040-94-3), בדימתיל סולפוקסיד (DMSO)) ב-500 μL של מאגר MES (10 mM, pH 7.1) למשך 30 דקות.
- הסר עודפי קרוסלינקר ורכז נוגדנים על ידי צנטריפוגה של תמיסת נוגדן-PEG במסנן צנטריפוגלי (MWCO 100 kDa). עבור המסננים הצנטריפוגליים המשמשים במחקר זה, בצע צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 14,000 x גרם ו 23 ° C. לשחזר את נוגדנים מצומדים בצינור טרי על ידי היפוך המסנן וצנטריפוגה ב 1,000 x גרם במשך 2 דקות.
- פיפטה את חלקיקי IR780 משלב 3.2 לתוך הצינור עם הנוגדנים ולהתסיס עם פיפטה כדי לערבב. לדגור על התערובת במשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר או ב 4 ° C במשך הלילה כדי ליצור αFR-NPs.
- כדי ליצור nt-NPs, הוסף 1% w/v methoxy-terminated (m)PEG5000-maleimide (CAS: 99126-64-4) מומס ב- DMSO לננו-חלקיקי IR140 SERRS משלב 3.2 ותן להגיב במאגר MES של 500 μL (10 mM, pH 7.1) למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, או ב- 4 ° C למשך הלילה.
- כדי לתת לעכברים (סעיף 4), יש לסובב את שני טעמי הננו-גשושית ב-11,000 x גרם למשך 4 דקות, לשאוף את הסופרנאטנט להסיר את התמיסה עם נוגדנים/PEG חופשיים שלא מגיבים, ולפזר מחדש כל טעם במאגר MES (10 מילימול, pH 7.1) בריכוזים של 600 pM. בעת השעיה מחדש של הננו-חלקיקים, צמצם חשיפה מיותרת לאולטרסאונד כדי למנוע דנטורציה של הנוגדן.
4. הזרקה והדמיה של ננו-גשושית
- הכינו ננו-גשושיות (αFR-NPs ו-nt-NPs) כמתואר בסעיפים 1-3 וערבבו ביחס של 1:1, לקבלת ריכוז סופי של 300 pM מכל סוג במאגר MES (10 mM, pH 7.1). לחלופין, הכינו תקני ייחוס של 30 pM של כל אחד מטעמי הננו-פרוב בצינורות חרוטיים קטנים (100 μL).
- הזריקו תוך צפקית 1 מ"ל של תרחיף הננו-חלקיקים בכל עכבר ועסו בעדינות את הבטן כדי לפזר את הננו-חלקיקים בתוך חלל הצפק. להחזיר את העכבר לדיור שלו. לאחר 25 דקות או יותר, הרדימו את העכבר באמצעות חנק CO2.
- הדקו את העכבר על משטח כירורגי, במצב שכיבה (להדמיית בטן שלמה, יש להרכיב את הפלטפורמה על שלב המיקרוסקופ הזקוף).
- באמצעות מלקחיים משוננים ומספריים דיסקציה, להסיר את העור כדי לחשוף את הצפק ולבצע חתך גדול sagittal (בין 2 ל 3 ס"מ אורך) לחשוף את כל הבטן. חברו את דשי הצפק לפלטפורמה. לשטוף את החלק הפנימי של חלל הצפק עם לפחות 60 מ"ל של PBS באמצעות בקבוק להשפריץ פלסטיק.
הערה: כדי לאפשר הדמיה ללא הפרעה של כל הבטן, יש לגייס או לכרות את המעיים. עבור כריתה, reect עם קשירה של כלי mesenteric על מנת להפחית דימום לתוך חלל הבטן.
- לחלופין, כדי לצלם איברים ספציפיים, הבלו אותם לאחר שטיפת PBS, והניחו אותם על שקופית מיקרוסקופ.
- העבר את הפלטפורמה או המגלשה למיקרוספקטרופוטומטר ראמאן עם תצורה אופטית זקופה ובמה ממונעת להדמיה; השתמש במערכת מסחרית עם לייזר דיודה 300 mW 785 ננומטר, עם סורג של 1,200 חריצים למ"מ, ממורכז 1,115 cm-1.
- התמקדו בתחום העניין באמצעות אופטיקה של אור לבן, פרפוקלית עם לייזר ראמאן. בחר את האזור לתמונה ואת הרזולוציה הרצויה; בדו"ח זה נעשה שימוש במצב רכישה במהירות גבוהה (ספקטרום שנרכש תחת תאורת לייזר רציפה כאשר שלב המיקרוסקופ נע ללא הרף, עם רזולוציה מרחבית אפקטיבית 14.2 מיקרומטר על 200 מיקרומטר; בהגדלה פי 5, הספק של 100 מיליוואט במטרה, וחשיפה של <100 מילישניות לנקודה).
הערה: ניתן למקם את הצינורות עם ננו-גשושיות הייחוס משלב 4.1 בתוך האזור המצולם במידת הצורך, כדי לספק תקני ייחוס פנימיים לניתוח הבא. ודא שאף מקור אור חיצוני מלבד הלייזר אינו מגיע למטרה.
- לחלופין, הכינו את הדגימה לעיבוד היסטולוגי ותיקוף על ידי קיבוע ב-4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך הלילה ב-4°C. שטפו עם PBS ב-4°C במשך 15 דקות לפחות פעמיים. שמור את הדגימה באתנול 70% במים עד לעיבוד היסטולוגי סטנדרטי והטמעת פרפין. לצורך אימות היסטולוגי של הגידולים, ניתן להכתים חלקים (בעובי 5 מיקרומטר) מעומקים שונים של גוש הפרפין בהמטוקסילין ובאאוזין (H&E).