מערכת תרבית פרוקסימלית: טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר איתות פרקריני בין תאים

תקציר

מקור: Dasari, S. et al. שיטת תרבית פרוקסימלית לחקר איתות פרקריני בין תאים.J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה אנו מפתחים מודל תרבית משותפת פרוקסימלי של תאי סרטן השחלות ותאי מזותל אנושיים ראשוניים. מודל פיזיולוגי רלוונטי זה מאפשר לחקור איתות פרקריני, שבו נשמרים הריכוזים המקומיים של הגורמים המופרשים תוך מניעת מגע תאי ישיר.

פרוטוקול

A. הכנת תאים

1. בידוד ותרבית של תאים מזותליים ראשוניים אנושיים
   1. בודדו תאי מזותל ראשוניים אנושיים (HPMCs) מהאומנטום האנושי וגדלו אותם במדיום גדילה שלם [מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) המכיל 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% ויטמינים] ב-37°C ו-5% CO₂.
      הערה: HPMCs גדלים בדרך כלל למפגש של 100% (איור 1A).
2. תנאי גידול של תאי סרטן השחלות
   1. לגדל תאי סרטן שחלות HeyA8 במדיום צמיחה מלא ב 37 ° C ו 5% CO₂.
      הערה: השתמשו בתאי HeyA8 שגדלו למפגש של כ-80% (איור 1B).

B. תרבית תאים

1. מערך תרבות פרוקסימלי
   1. השתמש בתוספות Transwell עבור לוחות 6 בארות עם קרום פוליקרבונט בעובי 10 מיקרומטר שטופל בתרבית רקמה עם נקבוביות 0.4 מיקרומטר (10,⁸ נקבוביות/ס"מ²) ואזור צמיחה^{של 4.67} ס"מ 2. במידת הצורך, מטב עבור גדלי הוספה שונים על ידי שינוי גודל מספר התאים שנזרעו בהתאם לשטח פני השטח של הגידול. יש לחמם את מצע הגידול המלא, טריפסין ומלח חוצץ פוספט (PBS) עד 37°C לפני השימוש.
2. הכנת התוספות
   1. כדי לזרוע את תאי HeyA8 על פני השטח התחתונים של הממברנה של העלון, מוציאים את האינסרט מאריזתו באמצעות מלקחיים סטריליים ומניחים אותו הפוך בכלי תרבית סטרילי בקוטר 15 ס"מ.
   2. השתמשו בכלי בקוטר 15 ס"מ, מכיוון שיש לו את העומק המתאים לתוספת ההפוכה, או החליפו אותו בכל מיכל סטרילי מתאים. בהתאם לניסוי, מניחים את מספר התוספות הנדרש בצלחת בגודל 15 ס"מ.
   3. תייג את שלושת הפקדים ושלושת התנאים הניסיוניים בהתאם עם סמן בקצה התוספות.
3. הכנת התאים הסרטניים
   1. כדי לטריפסין את תאי HeyA8 הגדלים במפגש של 80% בבקבוק²⁵ ס"מ 2 (~ 2 x 10⁶ תאים), הוסף 1 מ"ל טריפסין (0.25%) עבור 40-60 שניות ונטרל את הטריפסין עם 6 מ"ל של מדיום גידול מלא.
   2. צנטריפוגה את התאים ב 500 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות, להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של מדיום צמיחה שלם. ספור את התאים החיים באמצעות שיטת הרחקת הצבע הכחול טריפאן.
4. Seeding the cancer cells
   1. השהה 100,000 תאים/מ"ל של תאי HeyA8 חיים במדיום צמיחה מלא. זרעו בזהירות 80,000 תאי HeyA8 המרחפים ב-800 מיקרוליטר של מצע גידול מלא בתחתית העלון (שכעת פונה כלפי מעלה, מכיוון שהוא הפוך).
   2. זרעו את התאים ליצירת צורה דמוית כיפה כך שהתאים יישארו על האינסרט (איור 1C). התחילו ממרכז הממברנה ונעו החוצה במעגלים קונצנטריים תוך כדי פיפטינג איטי. הימנע ממעבר של יותר מ-3 מ"מ מהקצה כדי למנוע שפיכה של המדיום.
      הערה: מספר התאים שנזרעו יהיה תלוי בקצב הגדילה של התאים ובמשך הניסוי. מספר תאי HeyA8 שנזרעו עבור תרבית פרוקסימלית זו עבר אופטימיזציה, והתאים יהיו 80-90% מתמזגים בסוף היום השלישי.
5. התקשרות לתאים סרטניים
   1. מכסים את התבשיל בקוטר 15 ס"מ ומעבירים בזהירות את התבשיל המכיל את התוספות לאינקובטור CO₂. זה קריטי לא לשבש את הירידה של מדיום ותאים על הכנס בשלב זה. השאירו את התאים בטמפרטורה של 37°C למשך 4 שעות כדי לאפשר לתאים הסרטניים להיצמד לעלון.
6. הכנת התאים המזותליים
   1. לאחר כ -4 שעות, טריפסין HPMCs גדל ב 100% מפגש ב 75 ס"מ² בקבוק (~ 4 x 10⁶ תאים) עם 2 מ"ל של טריפסין (0.25%) במשך 1-2 דקות ולנטרל את הטריפסין עם 12 מ"ל של מדיום גידול מלא.
   2. צנטריפוגה את התאים ב 500 x גרם ב RT במשך 3 דקות, להשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של מדיום גידול מלא, ולספור את התאים החיים באמצעות שיטת הרחקת צבע כחול טריפאן.
7. זריעת התאים המזותליים
   1. השהה 300,000 תאים/מ"ל של HPMCs חיים במדיום גידול מלא. הוסף 2.5 מ"ל של מצע צמיחה שלם טרי לכל באר של צלחת 6 בארות. הוציאו בזהירות את התבנית בקוטר 15 ס"מ המכילה את התוספות למכסה המנוע של הבטיחות הביולוגית. בעזרת מלקחיים סטריליים, הפכו את האינסרט והניחו אותו בבאר של צלחת 6 הקידוחים כך שהיא תהיה זקופה, כאשר תאי HeyA8 מחוברים למשטח התחתון שקועים במצע הגידול המלא (איור 1C).
   2. זרעו 450,000 HPMCs מרחפים ב-1.5 מ"ל של מדיום גידול בחלק הפנימי של התוספות עם תאי HeyA8 מחוברים למשטח הפונה לתחתית הבאר (איור 1C) או לתוספות ללא תאי HeyA8 עבור פקדי HPMC. הוסף 1.5 מ"ל של מדיום גידול ללא תאים לבקרות HeyA8.
8. גידול התרבות הפרוקסימלית
   1. תן לתרבות הקרובה לגדול בחממת CO₂ ב 37 ° C ו 5% CO₂ במשך 72 שעות. במידת הצורך, המדיום ניתן לחדש כדלקמן.
      1. עבור החלק הפנימי של העלון, להסיר 750 μL ולהוסיף 750 μL של מצע צמיחה שלם טרי.
      2. עבור החלק החיצוני של התוספת (צלחת 6 בארות), להסיר 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום צמיחה שלם טרי. 1 מ"ל נבחר לנוחות של שינוי המדיום בשלב אחד. אם תרצה, 1.25 מ"ל ניתן להסיר ולהחליף במקום.

תוצאות

איור 1: הרכבה של מערכת התרבות הפרוקסימלית.(A) לוח זה מציג תאים מזותליים ראשוניים אנושיים (HPMCs). (B) פאנל זה מציג תאי סרטן שחלות מסוג HeyA8. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר (A-B). (C) תאי HeyA8 נזרעו על פני השטח התחתונים של תוספת טרנסוול עם נקבוביות של 0.4 מיקרומטר. לאחר חיבור התאים, האינסרט הונח בבאר של צלחת בת 6 בארות המכילה מצע גידול....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיכה חדירה לשקוף 24 מ"מ עם תוספת קרום פוליקרבונט נקבוביות 0.4 מיקרומטר	קורנינג (כוכב)	3412	• קרום פוליקרבונט שקוף שקוף בעובי 10 מיקרומטר. • מטופל לחיבור תאים אופטימלי. • 6 תוספות ארוזות בצלחת 6 בארות, 4 צלחות לכל מארז. • יש להכתים את הממברנה לנראות התא. • מעוקר על ידי קרינת גמא.
6 צלחת באר	קורנינג (פלקון)	353046	תחתית שטוחה, מטופלת TC, סטרילית, עם מכסה
צלחת תרבית בקוטר 15 ס"מ	קורנינג (פלקון)	353025	צלחת תרבית תאים סטרילית שטופלה ב-TC
DMEM	קורנינג (Cellgro)	10-013-CV
פניצילין סטרפטומיצין	קורנינג	30-002-CI
MEM חומצות אמינו לא חיוניות	קורנינג (Cellgro)	25-025-CI
פייפטס			כל ייצור הוא בסדר
אינקובטור CO2			כל ייצור הוא בסדר
ארון בטיחות ביולוגית ברמה II			כל ייצור הוא בסדר