מידול גרורות סרטן השחלות ברירית חלל הצפק: שיטה להקמת מודל תלת ממדי במבחנה של רירית הצפק

תקציר

מקור: Peters, P. N. et al. מידול השלבים הראשונים של הפצת סרטן השחלות בתרבות אורגנוטיפית של חלל הצפק האנושי. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו מדגימים פיתוח מודל תלת מימדי במבחנה של רירית חלל הצפק. תרבית אורגנוטיפית זו יכולה לסייע בחקירת הידבקות תאי סרטן השחלות, פלישה והתפשטות.

פרוטוקול

1. ציפוי התרבות האורגנוטיפית

1. שחררו NOF (פיברובלסטים אומנטליים רגילים) מבקבוק תרבית^{בגודל 75} ס"מ 2 על ידי שטיפה עם 10 מ"ל PBS ואחריו 3 מ"ל של 0.25% טריפסין/25 mM EDTA למשך לא יותר מ-5 דקות. נטרלו טריפסין עם נפח גדול פי 3 לפחות ממצע הגידול המלא.
2. מעבירים תאים טריפסיניים לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל ומסתובבים מטה במהירות של 0.5 גרם x 3 דקות. מוציאים סופרנאטנט ומחזירים תאים למעלה ב-5 מ"ל של מצע גידול מלא. השתמש מונה תאים כדי לספור את התאים שהתאוששו מבקבוק התרבית.
3. לדלל את התאים בנפח המתאים של מצע גידול מלא כדי צלחת 2,000-4,000 NOF לכל 100 μl על צלחת שחורה, שקופה, 96 באר. הוסיפו 0.5 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר קולגן I זנב חולדה לתערובת התאים לפני הציפוי. תן לתאים לשבת ב 37 ° C ב 5% CO₂ בסביבה לחה לפחות 4 שעות, או עד התאים להיצמד לפני השטח של הצלחת.
4. שחררו HPMC (תאים מזותליים אנושיים ראשוניים) מבקבוק התרבית באותן שיטות המתוארות בשלבים 1.1 ו-1.2. לדלל את התאים בכמות המתאימה של מצע גידול מלא כדי צלחת 10,000-20,000 HPMC לכל 50 μl על גבי NOF כבר מצופה קולגן I בלוחות 96 באר. תן לתאים לשבת ב 37 ° C ב 5% CO₂ בסביבה לחה לפחות 18 שעות לפני תחילת הניסויים.
5. תרבית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) - המבטא תאי סרטן שחלות HeyA8 במצע גדילה מלא. תאי סרטן השחלות HeyA8 מסומנים באופן פלואורסצנטי על ידי ביטוי של וקטור לנטיויראלי המבטא copepod cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). תאי סרטן השחלות HeyA8 צריכים להיות 80-90% במפגש ביום השימוש (שלב הצמיחה הלוגריתמית). שחרר תאים מלוח התרבית וספור באמצעות אותן שיטות המתוארות בשלבים 1.1-1.2 עבור תאים ראשוניים.
6. לאפשר לתאי סרטן השחלות להתאושש במצע גדילה מלא למשך 15-20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בצינור חרוטי כשהמכסה אטום באופן רופף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
PBS	פישר סיינטיפיק	SH3001304
כלי תרבות בקוטר 15 ס"מ	BD Biosciences	353025
DMEM עם L-גלוטמין	קורנינג	10-013-CV
ויטמינים MEM	קורנינג	25-020-CL
MEM חומצות אמינו לא חיוניות	קורנינג	25-025-CI
פניצילין-סטרפטומיצין	קורנינג	30-002-CI
שאכר	תרמו-פישר	MaxQ 4450
צנטריפוגה	אפנדורף	5702
אינקובטור	תרמו-פישר	מעיל מים פורמה סדרה II אינקובטור CO2 דגם 3100
טריפסין EDTA, 1x (0.25%)	קורנינג	25-053-CI
צלוחיות T-75	BD Biosciences	353136
צלוחיות T-175	BD Biosciences	353112
טיפים לפיפט	ריינין	P2, P10, P20, P200 ו-P1000
טיפים לפיפט	קורנינג	טיפים מסוננים P2, P10, P20, P200 ו-P1000
מונה תאים	Invitrogen	רוזנת
תא ספירת תאי הרוזנת שקופיות	Invitrogen	C10313
טריפאן כתם כחול (0.4%)	גיבקו	15250-061
קולגן סוג I (זנב חולדה)	BD Biosciences	354236
צלחת 96 באר, תחתית שקופה, שחור	BD Biosciences	353219