$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. בידוד ותרבית של תאי סטרומה ראשוניים שלא עברו טרנספורמציה
- איסוף רקמות אנושיות והכנתן.
- השיגו דגימות של אומנטום אנושי, בגודל 2 ס"מ3, שהוסרו במהלך ניתוח בטן, וטבלו מיד רקמות במי מלח חוצצי פוספט RT (PBS) (איור 1A). פיסת אומנטום בגודל 3 ס"מ x 2 ס"מ מניבה בדרך כלל מיליון תאים מזותליים אנושיים ראשוניים (HPMC) ו-200,000 פיברובלסטים אנושיים ראשוניים או פיברובלסטים אומנטליים רגילים (NOF).
- סובב את PBS הרקמה היה שקוע ב 0.5 x גרם במשך 3 דקות בהקדם האפשרי לאחר איסוף (< 2 שעות PBS) ולהעביר את הרקמה טרי 20 מ"ל PBS בצינור חרוטי 50 מ"ל. חתכו רקמה לחתיכות בגודל 5 מ"מ3 על-ידי טחינה עם אזמלים בצלחת תרבית סטרילית בקוטר 15 ס"מ (איור 1B).
- בידוד ראשוני של תאי מזותל אנושיים
- כדי לבודד HPMC, העבירו את הרקמה הטחונה לתוך צינורות חרוטיים של 50 מ"ל והמתינו דקה אחת עד שהחתיכות המוצקות יצופו למעלה (איור 1C ו-D). HPMC ותאי דם אדומים (RBC) יהיו נוכחים בנוזל בתחתית. השתמש פיפטה כדי להסיר את הנוזל מתחתית הצינור לתוך צינור חרוטי חדש. סובבו את הנוזל מטה ב-0.5 x גרם במשך 3 דקות ושאפו את הסופרנאטנט מכדורית HPMC/RBC.
- חזור על התהליך שלוש פעמים: הוסף PBS של 20 מ"ל לרקמה הטחונה, אפשר לרקמה לעלות, הסר נוזל מהתחתית עם פיפטה לתוך צינור HPMC/RBC, הסתובב כלפי מטה והסר את הסופרנטנט. לאחר השלמת כל הסיבובים ושאיפת הסופרנאטנט, הגלולה תכיל HPMC ו-RBC.
- צלחת את כל התאים מן הגלולה לתוך בקבוק75 ס"מ 2 ב 15 מ"ל של מדיה צמיחה מלאה (DMEM עם 10% סרום בקר עוברי [FBS],1% ויטמינים MEM [93 מ"ג / ליטר], 1% MEM חומצות אמינו לא חיוניות [81.4 מ"ג / ליטר], 1% סטרפטומיצין פניצילין [Pen-Strep, 100 U / ml פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין]).
- בצע שטיפת PBS משנית כדי לבודד HPMCs נוספים.
- לשטיפת PBS משנית, נערו את הרקמה המוצקה הנותרת ב-200 סל"ד, 37°C למשך 10 דקות ב-20 מ"ל PBS, ולאחר מכן המתינו דקה אחת עד שהרקמה צפה למעלה. מוציאים את הנוזל מתחתית הצינור לתוך צינור חדש, צנטריפוגה ב 0.5 x גרם במשך 3 דקות, ושאפו את supernatant.
- צלחת את כל HPMC / RBC מן PBS משני לשטוף נפרד 75 ס"מ2 בקבוק ב 15 מ"ל של מדיה צמיחה מלאה.
- כדי לבודד את שאריות HPMC, נער את הרקמה הטחונה במהירות 200 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב-20 מ"ל של תמיסת טריפסין 1:1 0.25% 25 mM EDTA:PBS לפי נפח. אפשרו לרקמה לעלות, אספו את הנוזל שבתחתית הצינור לתוך צינור חדש של 50 מ"ל, והסתובבו מטה ב 0.5 x גרם במשך 3 דקות.
- שואפים את הסופרנאטנט וצלחת את כל HPMC/RBC בבקבוק נפרד בגודל 75 ס"מ2 ב-15 מ"ל של מצע צמיחה מלא.
- תרבית את התאים המצופים בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 בסביבה לחה. הזנה של תאים מצופים על ידי הוספת 15 מ"ל של מצע צמיחה מלא בימים 3 ו -5 מבלי להסיר את המדיה בילה. HPMC ניתן לתרבית במשך 5-7 ימים לפני פיצול.
- השתמש HPMC במעבר נמוך (עד מעבר 2) בכל הניסויים כדי למזער דיפרנציאציה ושינוי של פנוטיפ מקורי. השתמש במיקרוסקופ רחב שדה רצוי עם מטרה 20x עם יכולות ניגודיות דיפרנציאליות פלסטיות או 4-20x אובייקטיבי עם יכולות ניגודיות פאזה (מסנני ניגודיות פאזה במיקרוסקופ) לצילום כל התמונות של תאים, ומטרה 10x () בשדה בהיר כדי לנתח צביעה אימונוהיסטוכימית 3,3'-Diaminobenzidine (DAB).
- אשרו שה-HPMC הם קובואידים ומבטאים ציטוקרטין 8 ווימנטין על-ידי ביצוע אימונוהיסטוכימיה (איור 2A, C, E).
