מידול התיישבות תאי סרטן השחלות של Omentum: שיטת Ex Vivo לביסוס התיישבות נקודה חלבית של תאי סרטן שחלות המסומנים באופן פלואורסצנטי בצמחי אומנטום מורין

תקציר

מקור: Krishnan, V. et al. In vivo and ex vivo גישות לחקר סרטן השחלות קולוניזציה גרורתית של מבני נקודות חלב בשומן פריטוניאלי. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה, אנו מקימים תרבית איברים אומנטליים ex vivo המכוסה בתאי סרטן שחלות המבטאים GFP כדי לחקור נשאות של סרטן השחלות בתוך הצמח האומנטי. פרוטוקול זה מנתח את מבני תאי מערכת החיסון בתוך האומנטום הידועים ככתמים חלביים המקדמים גרורות.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. התיישבות נקודה חלבית Ex Vivo

1. הקמת תנאי תרבית איברים בסיסיים ex vivo omental
   1. מניחים כל אומנטום בצלחת תרבית אחת, מכניסים ומניחים בתוך באר אחת של צלחת תרבית רקמה בת 12 בארות המכילה 500 μl של מדיה DME/F12 המכילה 20% FCS. שמור על תרביות איברים בטמפרטורה של 37°C בסביבה של 5% CO₂ למשך 24 עד 48 שעות ו/או נקודות זמן נוספות. השתמש בשלוש omenta בלתי תלויות (דגימות משולשות) עבור כל תנאי (לדוגמה, סוג מדיה/נקודת זמן).
   2. כדי לאשר את שלמות הרקמות בנקודות הקצה של הניסוי, תקן ועבד דגימות כמתואר בשלב 1.1.3. ספירת אדיפוציטים בריאים לעומת נמקיים במקטעי H&E יכולה להעריך את שלמות הרקמות. נדרש מינימום של ~120 תאים מחמש דגימות ביולוגיות כדי לגבש אחוז של רקמה חיה נוכחת.
   3. כדי למדוד את תפקוד הרקמה, מקם את omenta (n = 3) בבארות נפרדות של צלחת 24 בארות המכילה 500 μl של מדיה DME/F12 עם 20% FCS. אפשר ל-omenta לרכך את המדיה ב-37°C בסביבה של 5% CO₂ למשך 24 שעות ולאחר מכן להסיר 250 μl לשימוש בבדיקת IL-6 ELISA.
2. תרבית משותפת Ex vivo של omentum העכבר עם תאי SKOV3ip.1-GFP
   1. לגדל ולהכין תאים מתויגים פלואורסצנטית על ידי pipetting 1x10⁶ תאים מופשרים ב 10 מ"ל של מדיה בבקבוק T-75. אפשרו לתאים לגדול בטמפרטורה של 37°C בסביבה של 5%_CO2 עד שהם מגיעים למפגש של 70%. טריפסיניזציה והשעיה מחדש בריכוז של 2 x 10⁶ תאים למ"ל.
   2. יש למרוח ~6 μl של דבק הרקמה על קרום התרבית ולאפשר לו להתייבש באוויר. שטפו את הממברנה פעמיים במים סטריליים כדי להסיר דבק מוגזם. אוויר לייבש את הממברנות מתחת מכסה מנוע למינרי.
   3. בזהירות להסיר את omenta ולהצמיד אותו לקרום מצופה דבק באמצעות מלקחיים סטריליים. אפשר לרקמה להיצמד לממברנה למשך דקה אחת לפני הוספת מדיה. הוסף 500 μl של תרחיף התא על גבי כל omentum בכל תוספת תרבית. מלאו את האזור סביב תא הטרנסוול ב-2.5 מ"ל של DME/F-12.
   4. יש לדגור על אומנטה עם תרחיף תאים למשך 6 שעות ב-37°C בסביבה של 5%_CO2. בזהירות להסיר ולשטוף את omenta עם ~ 10 מ"ל של PBS. דמיינו מוקדי תאים סרטניים פלואורסצנטיים באמצעות מערכת הדמיה פלואורסצנטית מתאימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
כלי דיסקציה	כלים מדעיים משובחים	נה
גיימסה	פלוקה/סיגמא אולדריץ'	48900
5% פורמלין	סיגמא	HT501320
DMEM	קורנינג	10-013-CV
PBS	קורנינג	21-040-CV	ללא סידן ומגנזיום
קולגנאז	וורטינגטון	LS004196
הוספת צלחת תרבית מיליסל	מיליפור	PICM01250
סל-טאק	קורנינג	354240