1. היווצרות תאי סרטן השחלות
- תאי סרטן השחלות המבטאים RFP מגודלים בתרבית ב-10% Base Medium (מדיום תרבית תאים מותאם אישית המכיל תערובת של 50:50 של 199 ו-MCDB105, 10% סרום בקר עוברי מומת ו-1% Pen-Strep). כדי לבטא RFP בתאי סרטן שחלות לא מסומנים, הדבק את התאים עם פלסמיד המכיל RFP ובחר תאים המבטאים RFP. לחלופין, ניתן להשתמש בווקטורים נגיפיים כדי לבטא חלבונים פלואורסצנטיים באופן ארעי, או לדגור מראש תאים עם צבע מעקב אחר תאים פלואורסצנטיים אדומים (Invitrogen).
- לפני יצירת ספרואידים לסרטן השחלות, יש צורך להכין מנות תרבית עגולות 96 באר הדבקה נמוכה. כדי לייצר לוחות תרבית עם הדבקה נמוכה, יש להוסיף תמיסת פולי-HEMA של 30 מיקרוליטר (6 מ"ג פוליהידרוקסיאתיל-מתאקרילט ב-1 מ"ל 95% EtOH) לכל באר של צלחת תרבית תאים בת 96 בארות. לוחות 96 בארות מודגרים באינקובטור לא לח של 37 מעלות צלזיוס כדי לאדות את האתנול, ומשאירים סרט של פולי-HEMA על כל באר. סרט פולי-HEMA זה מונע מהתאים להיצמד לתחתית הבאר, ומאלץ את התאים לגדול בתרחיף. [לחלופין, ניתן להשתמש בצלחות תרבית התקשרות אולטרה-נמוכות (קורנינג).]
- לאחר מכן, טריפסיניזציה של תאי סרטן השחלות, משחררים את התאים בצנטריפוגה שולחנית (Heraeus) ב 900 RCF למשך 3 דקות. שאפו את הסופרנאטנט והשעו מחדש ב-10% מדיום בסיס.
- לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- התאם את ריכוז התאים כך שיהיו 100 תאים לכל 50 μL של 10% בסיס בינוני.
- הוסף 50 μL של תרחיף התאים המדולל המרחף באופן אחיד לכל באר של צלחת התרבית המצופה פולי-HEMA 96 בארות.
- לדגור על צלחת 96 בארות באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות (פרק זמן זה צריך להיות מוגבר או מופחת בהתאם למשך הזמן שלוקח לקו תאים מסוים ליצור ספרואידים רב-תאיים או לתנאי ניסוי רצויים) כדי לאפשר לתאי סרטן השחלות להתקבץ יחד, וליצור ספרואיד רב-תאי יחיד בכל באר. חלק מתאי הגידול יכולים לעבור אפופטוזיס בתקופה זו, ולכן חיוני לבחור זמן לפני השראת אפופטוזיס.
2. היווצרות חד-שכבתית של תאים מזותליים
- במכסה מנוע של תרבית תאים, מצפים מראש את הבארות של צלחת MatTek בעלת תחתית זכוכית 6 בארות בפיברונקטין על ידי הוספת 2 מ"ל של תמיסת PBS פיברונקטין / מ"ל 5 מיקרוגרם לכל באר של המנה ודגירת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. האיכות האופטית של תחתיות הזכוכית בצלחות MatTek מאפשרת הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה.
- תאים מזותליים המבטאים GFP מגודלים בתרבית ב-10% מדיום בסיס. טריפסיניז צלחת של תאים מזותליים, מסתובבים בצנטריפוגה שולחנית (Heraeus) ב-900 סל"ד למשך 3 דקות, שואפים את הסופרנאטנט, ומשעימים מחדש ב-10% מדיום בסיס. התאים המזותליאליים המשמשים כאן כבר ביטאו GFP כאשר הם התקבלו, אך תאים מזותליאליים ללא תווית יכולים להיות מיוצרים על ידי הדבקה עם פלסמיד המכיל GFP cDNA או דגירה מראש של התאים בצבע גשש תאים פלואורסצנטי ירוק (Invitrogen).
- לאחר דגירה פיברונקטין של 30 דקות (בשלב 2.1), לשטוף את הבארות של צלחת MatTek עם 2 מ"ל PBS.
- שאפו את PBS ואת צלחת 6 x105 תאים mesothelial לכל באר בכל באר של צלחת MatTek 6-well. לדגור על צלחת MatTek באינקובטור תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לתאי המזותל להיצמד לצלחת וליצור שכבה חד-שכבתית.
3. בדיקת פינוי תאים מזותליים
- השתמש פיפטה כדי לאסוף את ספרואידים סרטן השחלות מן צלחת מצופה פולי-HEMA 96 בארות.
- שאפו את התווך מבאר אחת של צלחת MatTek בעלת 6 בארות המכילה מונושכבה של תאים מזותליים. יש לשטוף פעם אחת עם 2 מ"ל PBS. הוסף את כל הספרואידים מהצלחת בת 96 הבארות לבאר אחת של צלחת MatTek (~ פי 3 ממספר הספרואידים שהולכים להיות מצולמים כדי להסביר את הנחיתה של הספרואידים על החלק של המנה שלא ניתן לדמיין).
- הניחו את צלחת MatTek על במה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה הפוך המסוגל לבצע הדמיה בהילוך מהיר למשך 8 שעות לפחות. השתמש בשלב ממונע כדי לצלם מיקומים מרובים בצלחת, עם אירועי אינטרקלציה ספרואידים מרובים, בניסוי יחיד. אנו משתמשים במיקרוסקופ בהילוך מהיר של Nikon Ti-E Inverted Motorized Widefield Fluorescence עם מערכת מיקוד מושלמת משולבת ואופטיקה עם צמצם נומרי נמוך [20x-0.75 (NA)], טרנסילטור הלוגן של Nikon עם מעבה למרחקי עבודה ארוכים (LWD) של 0.52 NA, מסנני עירור ופליטה מהירים של Nikon (<100 אלפיות השנייה) (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter נתיב אור מהיר ואפיפלואורסצנטי תריסים חכמים, שלב ממונע מקודד ליניארי של Nikon, מצלמת CCD (CCD) של Hamamatsu ORCA-AG מקורר טעינה, תא דגירה במיקרוסקופ שנבנה בהתאמה אישית עם בקרת טמפרטורה ו-CO2, תוכנת Nikon NIS-Elements AR גרסה 3 ושולחן בידוד רטט TMC.
- ספרואידים של תאי סרטן השחלות ישקעו בתחתית הצלחת ויתחברו לחד-שכבה של תאי המזותל. אסוף תמונות GFP, RFP ופאזות של 20+ אינטראקציות ספרואידיות/חד-שכבתיות כל 10 דקות, למשך 8 שעות.
- ספרואידים של תאי סרטן השחלות המבטאים RFP יפלשו לתוך חד-שכבה של תאים מזותליים המבטאים GFP וייצרו חור בחד-שכבתית. לאחר 8 שעות, מדדו את גודל החורים על ידי מעקב אחר החורים השחורים בתמונות GFP באמצעות תוכנת Elements (או תוכנה מתאימה אחרת כגון תמונה J). נרמל את גודל החור לגודל הספרואיד ההתחלתי על ידי חלוקת גודל החור ב- 8 שעות בגודל הספרואיד בתמונת RFP המתאימה בזמן אפס. בדוגמה זו, גודל החור נמדד רק פעם אחת, אך ניתן למדוד אותו מספר פעמים במהלך הניסוי בן שמונה השעות כדי להבין טוב יותר את הדינמיקה של האינטרקלציה.
