קביעת תדירות שדה מיטבית לטיפול בגידול מעכב עבור תאים סרטניים: שיטה לא פולשנית במבחנה להערכת ההשפעה של TTFields על כדאיות התא הסרטני

1. TTFields In Vitro Application System - תחזוקת צלחת בסיס וכלים

1. יש לשטוף כלים וכיסויי כלים תחת מי ברז זורמים. לאחר מכן, יש לשטוף במים נטולי יונים, ולייבש את הפנים באוויר כלפי מטה.
2. אם בניסוי קודם הוסיפו חומר כימותרפי/תרופה לכלים, מלאו כל מנה בתמיסת דטרגנט קלה 5% והשאירו למשך הלילה.
   1. שטפו את הכלים ביסודיות תחת מי ברז זורמים כדי למנוע עקבות של חומר ניקוי בתוך המנה. יש לשטוף את הכלים ואת כיסויי הכלים במים נטולי יונים, ולייבש באוויר עם הפנים כלפי מטה.
3. הכניסו את הכלים הנקיים והיבשים עם הכיסויים שלהם לשקיות עיקור. אוטמים ומניחים את השקיות באוטוקלאב, כשהכלים פונים כלפי מטה. Autoclave במשך 30 דקות ב לא יותר מ 121 ° C.
4. מניחים את האוטוקלאבה על תוכנית יבשה, פותחים חלקית את דלת האוטוקלב ומייבשים את הכלים למשך 30 דקות.
5. נגבו את צלחת הבסיס במטלית לחה קלות באתנול 70%.

2. מערך הניסוי

הערה: כל הציוד והחומרים המשמשים בפרוטוקול זה מתוארים ברשימת החומרים. כל השלבים הבאים צריכים להתבצע בתוך ארון זרימה למינרי תוך שמירה על תנאים סטריליים.

1. הכינו כלים וכיסויים נקיים וסטריליים של TTFields, כמתואר בסעיף 1. נגבו את צלחת הבסיס במטלית לחה קלות באתנול 70%.
2. התקינו את הכלים של TTFields עם הכיסויים על צלחת הבסיס על ידי לחיצה עדינה כלפי מטה על הצלחת וסיבוב בכיוון השעון בכ-5 מ"מ עד ששפת הכלי ננעלת על שלושת הפינים שבצלחת הבסיס. הניחו מכסה סטרילי בקוטר 22 מ"מ (פלסטיק מטופל או זכוכית) בתחתית כל צלחת.
3. הכינו את תרחיף התא במדיום גדילה מלא (מדיום הנשר המותאם של דולבקו עבור U-87 MG ו-F98; RPMI עבור A2780 ו- OVCAR-3; בתוספת כמתואר ברשימת החומרים).
   הערה: ריכוזי התאים תלויים בסוגי התאים ובמשך הניסוי; אין לחרוג מגידול תאים קונפלואנטי של 80%-90% עד סוף הניסוי.
   זהירות: קווי תאים אנושיים עלולים להוות סכנה ביולוגית ויש לטפל בהם באמצעי הבטיחות המתאימים.
4. מניחים 200 μL של תרחיף תאים (בדרך כלל 5,000-20,000 תאים ב 200 μL עבור ניסוי של 72 שעות, תלוי בזמן ההכפלה) כטיפה במרכז כל כיסוי ומכסים עם מכסי הכלים.
5. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור_CO2 עד שהתאים נצמדים; דגירה של לילה אפשרית בשלב זה.
6. שאפו את הנוזלים מהטיפה באמצעות פיפטה של 200 או 1,000 מיקרוליטר.
7. מזלפים בעדינות 2 מ"ל של מצע גידול מלא כדי למלא כל מנה. השתמשו בקצה סטרילי כדי לקבץ וטפחו ברכות על קצוות הכיסוי כדי לשחרר את בועות האוויר שנלכדו מדי פעם מתחת למגלשה.
8. כסו את הכלים עם המכסים שלהם והניחו אותם בתוך אינקובטור_CO2 בטמפרטורה של 37°C עד תחילת הטיפול ב-TTFields.

3. יישום TTFields

1. העבירו את לוחות הבסיס עם צלחות TTFields המצורפות לאינקובטור CO₂ מקורר.
   הערה: יישום TTFields במבחנה יפיק חום; לכן, אינקובטור קירור נדרש כדי לפצות על התחממות המנות. עוצמות TTFields גבוהות יותר יפיקו יותר חום וידרשו טמפרטורות סביבה נמוכות יותר באינקובטור (ראו טבלה 1). עוצמות TTFields רלוונטיות מבחינה קלינית מושגות כאשר טמפרטורת האינקובטור ליישום TTFields היא בטווח של 18-30°C.
2. חבר את מחבר הכבל השטוח ללוח הבסיס. הפעילו את מחולל TTFields.
3. הפעל את תוכנת מערכת היישומים במבחנה TTFields ובחר את הגדרות הניסוי.
   1. הגדירו ניסוי חדש. הקלד את שם הניסוי ואת שם בעל הניסוי בממשק המשתמש של התוכנה במסך המחשב. התאימו את התדירות ואת טמפרטורת היעד לכל מנה או צלחת בסיס.
4. הפעל את היישום TTFields באמצעות התוכנה.
5. ודא שכל הכלים מחוברים כראוי ומופיעים בצבע כחול בהיר על הצג. אם צלחת מוקפת מסגרת אדומה (כלומר היא לא מחוברת כראוי), לחצו עליה בעדינות וסובבו לאט קדימה ואחורה עד שהמגעים משוחזרים והצלחת נראית בצבע תכלת.
6. השאר את מערכת היישומים במבחנה של TTFields פועלת למשך עד 24 שעות.
7. אם הניסוי מגיע לנקודת הסיום שלו, עצור את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור END EXPERIMENT בתוכנה והמשך לשלב 5. אם לא, לחץ על PAUSE experiment.
8. נתק את מחבר הכבל השטוח מלוח הבסיס. מוציאים את צלחת הבסיס עם הכלים מהאינקובטור לתוך ארון זרימה למינרי.
9. מחליפים את המדיום בכל הכלים כל 24 שעות ומחזירים את צלחת הבסיס לאינקובטור הקירור. חבר את לוח הבסיס לגנרטור באמצעות הכבל השטוח. המשך את הניסוי על ידי לחיצה על כפתור המשך.

טבלה 1. טמפרטורת הסביבה של האינקובטור ועוצמות TTFields הצפויות בתוך צלחת TTFields.

4. דוגמאות בקרה

הערה: גידול תאי בקרה בתנאים דומים לתאים שטופלו ב-TTFields, למעט היישום TTFields.

1. דגימות בקרת לוחיות עם אותו מתלה ועל משטח דומה המשמש לציפוי דגימות שטופלו ב-TTFields.
2. מניחים צלחות בקרה באינקובטור CO₂ ב 37 ° C.
3. החליפו את המדיום בכלים כל 24 שעות כדי להתאים לתנאי המנה הבינונית שטופלו ב-TTFields.

5. סוף הניסוי

1. לאחר לחיצה על END EXPERIMENT, המתן עד שהתוכנה תאחזר את כל הרשומות מהמערכת ותשמור את הרשומות במחשב.
2. השתמש בלחצן REPORTS כדי לסקור את קובצי יומן הטמפרטורה, הזרם וההתנגדות של כל צלחת בסיס כדי לוודא שכל הכלים טופלו בהתאם לתוכנית הניסוי.
   הערה: כל הדוחות והיומנים נשמרים במחשב לאחר סיום הניסוי וניתן לסקור אותם בכל עת.
3. כבו את מחולל TTFields.
4. נתקו את הכבל השטוח מלוח הבסיס והוציאו אותו מהאינקובטור.
5. כדי להסיר צלחת קרמיקה, לחצו כלפי מטה וסובבו את הכלי נגד כיוון השעון כדי לפתוח אותו מצלחת הבסיס.
6. הכניסו את הכלים לארון זרימה למינרי והסירו את הכיסויים. העבירו אותם לצלחות פטרי סטריליות המכילות מלוחים טריים בינוניים או מלוחים חוצצים בפוספט (PBS) לבדיקה והערכה נוספות.