$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים לעוברי ביצי תרנגולת נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת הביצים
- לפני קבלת הביצים, יש להרכיב ולאזן את אינקובטור הביצים לטמפרטורה של 37.8°C (100°F) עם לחות של 60-70% בהתאם להוראות היצרן.
הערה: כדי למזער את סיכוני הזיהום, ניתן להשתמש במים אוטוקלאביים כדי לשלוט בלחות.
- עם קבלת ביצי תרנגולת אדומה מופרות מרוד איילנד מספק ביצים מוסמך במעבדה, יש לנגב יבש את פני הקליפות במגבות נייר. ניתן להשתמש במגבת נייר רטובה קלות כדי להסיר חומר מודבק. יבש מיד.
הערה: הרטבת הקליפה בנוזל מתחת ל-43.3 מעלות צלזיוס עלולה להכניס חיידקים לביצה. אם בוחרים לשטוף או לחטא את הביצים, טמפרטורת הנוזל חייבת להיות בין 43.3-48.9 מעלות צלזיוס. טמפרטורות גבוהות יותר יכולות להרתיח את הביצים. הבחירה של חומר חיטוי צריך להיעשות על בסיס מיקרואורגניזמים גורם דאגה.
- השתמש בעיפרון או בטוש כדי לסמן את התאריך על הביצה. זה נחשב יום פיתוח 0.
- מכניסים את הביצים לאינקובטור הביצים ודוגרים לפחות 7 ימים עם רוטציה כדי לאפשר התפתחות CAM. ניתן להשתמש במסובב אוטומטי, או לסובב את הביצים 180° 2-3x ליום.
2. פתיחת הביצים
הערה: פתיחת הביציות צריכה להיעשות כאשר ה- CAM התפתח במלואו. זה בדרך כלל ביום הפיתוח 7 או 8.
- יש לחטא ארון בטיחות ביולוגית באתנול 70%. באופן דומה, יש לחטא ולהכניס לארון הבטיחות הביולוגית מתלה ביצים, נר ביצים, טוש, כלי סיבובי אלחוטי עם אבן טחינה סיליקון קרביד וגלגל חיתוך עגול, מחט 18 גרם, בקר פיפטה עם צינורות ואקום בקוטר רבע אינץ', סרט אריזה, מספריים משרדיים, מספריים מעוקלים, מלקחיים Semken (או דומים), כדורי צמר גפן והלבשת סרט שקוף בגודל 6X7 ס"מ. במידת האפשר, השתמשו בכלים סטריליים, חד-פעמיים או אוטומטיים.
- כבו את מסובב הביצים. הכניסו כ-1-3 ביצים לארון הבטיחות הביולוגית שעל מדף הביצים. בחושך, הניחו את נר הביצים כנגד קליפת הביצה כדי לזהות את תא האוויר. סמן את מיקום תא האוויר.
הערה: עוצמת ההארה מנר הביצה חיונית לדמיון פנים הביצה. אם קשה לראות באופן עקבי את תא האוויר או כלי הדם, נסו להחליף את סוללות נרות הביצים.
- העבירו את נר הביצה מעל הקליפה כדי למצוא רשת כלי דם גדולה. סובבו את הביצה במידת הצורך. כלי דם אידיאלי יהיה מסתעף ליד אמצע הביצה. השתמש בטוש כדי לצייר מעל כלי הדם שישמשו להשתלה.
- הדליקו את האור במכסה המנוע. בעזרת כלי סיבובי אלחוטי המצויד באבן השחזה סיליקון קרביד, קודחים חור קטן בקליפה ישירות מעל מרכז תא האוויר. קודחים עד שרוב הקונכייה מוסרת, אך הקרום הפנימי הלבן שלם.
הערה: קידוח מעל תא האוויר לפני מיקוד כלי הדם מאפשר לקבוע את עובי קליפת הביצה המסוימת מעל תא האוויר ולא מעל ה-CAM וכלי הדם. אם ה- CAM או כלי הדם משובשים, אז הביצית אינה שמישה להשתלה.
- לקדוח ולפתוח חור קטן נוסף בו ייפתח חלון כלי הדם כפי שנעשה עבור תא האוויר (שלב 2.4).
- בעזרת מחט 18 גרם, חודרים בעדינות דרך הקרום הפנימי הלבן מעל תא האוויר וכלי הדם. אם לא ניתן לחדור את הקליפה, ואז בזהירות לקדוח קצת יותר. ודא שהקרום הפנימי הלבן (אך לא ה- CAM) משובש לאורך כל האזור שנקדח. הסרת חתיכת הממברנה אינה הכרחית.
הערה: אם ה-CAM או כלי הדם משובשים במהלך שלב זה, השליכו את הביצית. הנזק ניכר אם יש דם או אלבומין דולף מחור קדוח.
- כבו את תאורת מכסה המנוע. בעזרת נר הביצה, יש לוודא שתא האוויר הועבר מקצה הביצה לאזור שמעל כלי הדם. במידת הצורך, הניחו את צינור הוואקום המוכנס לבקר פיפטה סביב החור מעל תא האוויר המקורי והפעילו בעדינות יניקה בפרצים קצרים כדי להזיז את תא האוויר.
- השתמש בסמן כדי לשרטט את המיקום החדש של תא האוויר כ- 0.5 ס"מ בתוך גבול האוויר-CAM. הדביקו פיסת סרט אריזה מעל תא האוויר החדש. במידת הצורך, השתמש במספריים משרדיות סטנדרטיות כדי לחתוך את הסרט לגודל מתאים.
הערה: סרט הדבקה יכול לשבש את זרימת האוויר דרך הקליפה ולא צריך להיות גדול מהנדרש כדי לכסות את תא האוויר במלואו.
- מחזירים את הביצים לאינקובטור להתחמם ללא סיבוב כשתא האוויר החדש פונה כלפי מעלה. חזור על שלבים 2.2-2.9 לפתיחת הביציות הנותרות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אם אינך בטוח באיכות התפתחות CAM, מספר קטן של ביצים צריך להמשיך דרך שלב 2.16 לפני פתיחת הביציות הנותרות.
- הניחו כ-1-3 ביצים עם תאי אוויר שהועברו על מדף הביצים בארון הבטיחות הביולוגית.
הערה: יש להקפיד להימנע מהחדרת זיהום לביצה הפתוחה. לכן, תמיד לפתוח ביצים בתוך ארון בטיחות ביולוגית, ולהשתמש בכלים סטריליים וציוד במידת האפשר.
- באמצעות כלי סיבובי אלחוטי המצויד בגלגל חיתוך מעגלי, חותכים קו קטן מעל גבול תא האוויר המשורטט בשלב 2.8. ודא כי זה בערך 0.5 ס"מ בתוך גבול air-CAM בפועל כדי למנוע הפרעה CAM או כלי הדם. חתכו לחלוטין דרך הקליפה אך היזהרו לא לחדור עמוק מספיק כדי לשבש את ה-CAM או כלי הדם.
- בעזרת מספריים מעוקלים, חותכים סביב תא האוויר הנותר כדי ליצור חלון במעטפת.
הערה: אם דם או קרום קיים על הקליפה שהוסרה, אז הביצה אינה מתאימה להשתלה. אם חלק גדול מהביצים אינן נפתחות בצורה נקייה, שקול להמתין לפחות יום אחד נוסף כדי לפתוח את הביצים הנותרות כדי לאפשר היווצרות CAM טובה יותר. אם קליפות הביצים הנותרות לא נוקבו, יש לחדש את סיבוב הביצים בתוך האינקובטור.
- לוודא את הכדאיות של העובר. עוברים בני קיימא יציגו כלי דם נרחבים, אלבומין שקוף, תנועת עובר או פעימות לב נראות לעין.
- בעזרת מלקחיים Semken, למשוך חתיכות קטנות של כותנה מתוך כדור צמר גפן סטרילי. כתם בעדינות את משטח ה- CAM כדי להסיר את אבק המעטפת והפסולת.
הערה: פינוי הפסולת חייב להתבצע באותו יום שבו נפתחות הביצים.
- מכסים את פתח המעטפת ברבע חתיכה של הלבשת סרט שקוף בגודל 6X7 ס"מ.
- מחזירים את הביצים לאינקובטור. ודא שהביצה יושבת היטב כשהחלון הפתוח פונה כלפי מעלה וה- CAM אינו נוגע ברוטב הסרט השקוף. השתמשו בחתיכת מתלה ביצים, בקצה מסובב הביצים או בפריט מתאים אחר כדי לתמוך בביצים שממשיכות להתגלגל.
- חזור על שלבים 2.10-2.16 כדי שכל הביציות הנותרות ייפתחו.
הערה: אין צורך להשלים את פתיחת הביציות באותו יום של ההשתלה. המתנה של יום אחד לפחות יכולה לעזור לחסל ביצים שהכדאיות שלהן נפגעה על ידי פתיחת הקליפה.