מודל סרטן מבוסס קרום עוף Chorioallantoic: מודל In Ovo לחקר גידולים וגרורות של תאים סרטניים

תקציר

מקור: Sharrow, A. C. et al. שימוש במודל קרום כוריואלנטואי עוף in vivo לחקר סרטן גינקולוגי ואורולוגי. J. Vis. Exp.(2020)

בסרטון זה, אנו מתארים השתלה של תאים סרטניים על קרום כוריואלנטואי של תרנגולת כדי ליצור מודל in ovo. המודל משתיל בהצלחה את תאי סרטן השחלות כדי לחקור את התקדמות הסרטן הגינקולוגי.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תרחיף התא הסרטני להשתלה (אפשרות 1)

הערה: יש להשלים זאת ממש לפני ההשתלה, שאמורה להתרחש באופן אידיאלי בין הימים 7 ל -10. אנא עיין בהערות בתחילת שלב 3 או 4 לקבלת מידע נוסף לגבי תאריך ההשתלה. גישה זו שימשה לכל קווי התאים ולעיכול גידולי סרטן הכליה בתרבית.

1. הפשירו את תמיסת המטריצה החוץ תאית על קרח.
2. באמצעות עיכול מכני ו / או אנזימטי, להשיג תרחיף תא בודד בשיטה המתאימה לסוג התא המושתל.
3. השהה מחדש את המספר הכולל של תאים שיושתלו במדיום מתאים להשתלה. שתלים של 1-2 x 10⁶ תאים לכל ביצית אופייניים.
   הערה: המדיום המשמש להשתלת קווי התאים הוא בדרך כלל המדיום המלא המשמש לגידול התאים, המכיל FBS או החלפת סרום. ההשתלה של עיכול הגידול משתמשת בדרך כלל בתווך המלא המשמש לתרבית קווי תאים מאותו סוג סרטן. עם זאת, ניתן לבצע התאמות לנוסחה הבינונית במידת הצורך בניסוי. ההשפעות על התפתחות הגידול וצמיחתו יצטרכו להיקבע אמפירית.
4. גלול את התאים באמצעות צנטריפוגה במהירות ובזמן המתאימים לתאים הנמצאים בשימוש. מהירויות אופייניות הן 250-300 x גרם, והזמנים הם 5-10 דקות.
5. הסר את supernatant מן התאים pelleted על ידי pipetting. השהה מחדש באופן מכני את התאים בתווך השיורי באמצעות הבהוב או פיפטינג. מניחים על קרח להתקרר. מדוד את נפח התאים והמדיום באמצעות פיפטה בגודל מתאים.
6. חישוב נפחי ההשתלה כך ש-1-2 x 10⁶ תאים מושתלים בנפח של 20-100 מיקרוליטר לביצית עם ריכוז מטריצה חוץ-תאי סופי של 2.7-4 מ"ג/מ"ל חלבון. הוסף מדיום, כל גורמי גדילה רצויים או תוספים, ותמיסת מטריצה חוץ-תאית לפי חישוב זה. שמור על קרח עד מוכן להשתלה.
   הערה: לצורך החישובים בשלבים 1.3 ו-1.6, יש לשלב נפח נוסף של לפחות חצי שתל ביצית כדי להבטיח נפח מספיק לכל הביציות בקבוצה. לצורך השתלת שורות תאי סרטן השחלות (כלומר, SKOV3 ו- ID8), הושתלו 10⁶ תאים לכל ביצית. לצורך השתלת קו תאי קרצינומה של תאי הכליה RENCA, תאים בתרבית שמקורם בקרצינומה ראשונית של תאי כליה אנושיים מעוכלים, שורות תאי סרטן הערמונית (כלומר, CWR, C4-2 ו- MyC-CaP), ושורות תאים של סרטן שלפוחית השתן (כלומר, HT-1376 ו- T24), הושתלו 2 x 10⁶ תאים.

2. הכנת חלקי גידול להשתלה (אפשרות 2)

הערה: יש להשלים זאת ממש לפני ההשתלה, שאמורה להתרחש באופן אידיאלי בין הימים 7 ל -10. אנא עיין בהערות בתחילת שלב 3 או 4 לקבלת מידע נוסף לגבי תאריך ההשתלה. סרטן שחלות וסרטן שלפוחית השתן הראשוני הושתלו כחתיכות גידול.

1. הפשירו תמיסת מטריצה חוץ-תאית על קרח. יש לדלל לריכוז חלבון סופי של 2.7-4 מ"ג/מ"ל בתווך מתאים המכיל את כל גורמי הגדילה או התוספים הרצויים. שמור על קרח.
   הערה: השתלת חתיכות גידול משתמשת בדרך כלל במדיום המלא המשמש לתרבית קווי תאים מאותו סוג סרטן. עם זאת, התאמות לניסוח הבינוני עשויות להיעשות במידת הצורך בניסוי. ההשפעות על קליטת הגידול וצמיחתו יצטרכו להיקבע אמפירית.
2. באמצעות אזמל או מספריים, הבלו חתיכות מן הגידול הטרי. גדלים אידיאליים נעים בין 2-5 מ"מ מכל צד. שמור על רקמות שקועות בתווך עד שהן מוכנות להשתלה.

3. השתלה באמצעות טבעת נון סטיק (אפשרות 1)

הערה: ניתן להשתיל תאים החל מיום ההתפתחות השביעי אם ה-CAM מפותח במלואו. ההשתלה יכולה להתרחש בכל עת לפני הבקיעה המאפשרת זמן מספיק להתפתחות הגידול ולניסוי הרצוי, אך שימו לב שתאי החיסון של העובר מתחילים להיות נוכחים סביב היום ה-10 לאחר ההפריה. קצב צמיחת הגידול משתנה במידה ניכרת לפי סוג התא ויש לקבוע אותו אמפירית עבור סוג התא המעניין. סרטן השחלות ותאי סרטן הערמונית הושתלו בשיטת Nonstick Ring. שימו לב שכאשר טבעת נון סטיק אינה זמינה, ניתן לחתוך קצה פיפטה לגודל דומה ולהשתמש בו.

1. השתמש באתנול 70% לחיטוי ארון בטיחות ביולוגית וכל הכלים הנדרשים: מתלה ביצים, מלקחיים קשתית מעוקלת, טבעות נון-סטיק (קוטר פנימי של 1/4 אינץ '), מוט ערבוב זכוכית, פיפטות וטיפים מתאימים בנפח, הלבשת סרט שקוף בגודל 6X7 ס"מ, מספריים משרדיים וטוש או עיפרון. במידת האפשר, יש להשתמש בכלים סטריליים, חד פעמיים או אוטומטיים.
2. הניחו ביצים להשתלה על מדף ביצים בארון בטיחות ביולוגית. בחר מספר ביצים הניתן לניהול. עד שישה זה אופייני. הימנעו מלאפשר לביצים להתקרר באופן משמעותי בזמן העבודה איתן.
3. הסר את הלבשת הסרט השקוף מהמעטפת על ידי גלגול הקצוות לכיוון החלון הפתוח כדי למנוע משיכת חתיכות קליפה. בדקו שהביצים בנות קיימא ובריאות. ביצים אידיאליות יהיו כלי גדול במרכז השטח הפתוח עם כלי קטן יותר מסתעף ממנו.
4. בעזרת מלקחיים קשתית מעוקלת, הניחו טבעת סטרילית ונון-סטיק על ה-CAM מעל הכלי, רצוי מעל נקודת הסתעפות. השתמש במוט ערבוב זכוכית סטרילי כדי לנטוש בעדינות את ה- CAM.
5. מחברים את מתלה התא משלב 1.6 למרכז טבעת הנון-סטיק. לחלופין, השתמשו במלקחיים כדי למקם חתיכת גידול משלב 2.2 למרכז טבעת הנון-סטיק ולכסות ב-20-50 מיקרוליטר של תמיסת המטריצה החוץ תאית שנוצרה בשלב 2.1.
6. אטמו את הפתח ברבע פיסת פילם שקוף בגודל 6X7 ס"מ. תייג את הביציות עם ייעוד השתל המתאים.
   הערה: מספור הביציות בתוך קבוצה מאפשר תצפיות אורך.
7. מחזירים את הביצה לאינקובטור. ודא שפתח הקליפה יושב זקוף ושהביצה בטוחה.
   הערה: ניתן להחזיר ביצים לאינקובטור ביצים ללא סיבוב. לחלופין, ניתן להשיג כדאיות גבוהה לאחר השתל באמצעות אינקובטור תאים של 37-38 מעלות צלזיוס עם CO₂ מנוטרל ומד לחות לניטור הלחות, שאמורה להיות 50%-80%.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
010 טפלון (PTFE) לבן 55 דורו שור D O-Rings	חנות O-Ring	TEF010	טבעת נון-סטיק לזריעת תאים. 1/4"מזהה X 3/8"OD X 1/16" CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
מספריים להפעלה עדינה; מעוקל; חד-חד; אורך להב 30 מ"מ; 4-3/4 אינץ' אורך כולל	רובוז כירורגי	RS6703	זה מובא כדוגמה. כל מספריים מעוקלים דומים יעבדו גם כן.
ערכת כלים Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max	דרמל	8050-נ/18	ערכה זו מכילה את כל הכלים הדרושים
ביצי תרנגולת מופרות (רוד איילנד אדום - חום, כיתה מעבדה)	AA Lab ביצים בע"מ	לא ישים	יהיה צורך לזהות ספק ביצים מקומי, מכיוון שספק זה מספק רק באופן אזורי.
Hovabator Genesis 1588 ערכה משולבת של חממת ביצים דלוקס	מחסן החממה	HB1588D-אף אחד-1102-1588-1357	ניתן להשתמש באינקובטורים אחרים של ביצים, אך יהיה צורך לאמת את אמינותם. לאחר ההשתלה, ניתן להשתמש גם באינקובטור תאים עם CO2 מושבת.
Incu-Bright Cool נר ביצים קל	מחסן החממה	1102	ניתן להשתמש בנרות אחרים, אך זה מועדף בין אלה שבדקנו. נר זה כלול בערכת החממה הנ"ל.
מטריגל ממברנה מטריקס HC; ללא LDEV	קורנינג	354248	פתרון מטריצה חוץ-תאי
SKOV3	ATCC	HTB-77	קו תאי סרטן השחלות האנושי.
מוטות ערבוב עם שוטר גומי; קוטר 5 מ"מ, אורך 18 ס"מ	אספקה מדעית מאוחדת	GRPL06	זה מובא כדוגמה. כל מוטות ערבוב זכוכית דומים יעבדו גם כן.
מלקחיים לדוגמה	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72914	זה מובא כדוגמה. המלקחיים המשמשים למשיכת הקונכייה להדמיית ביולומינסנציה הם באורך של כ-12.8 ס"מ עם קצוות ברוחב 3 מ"מ.