Agarose Spin Down Assay: טכניקה להטמעת אורגנואידים לניתוח היסטולוגי

תקציר

מקור: Lee, S. et al. הקמה וניתוח של אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בסרטן הערמונית של חולה, דגימות גרורות עצם והקסנוגרפטים שלהם. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מבצעים בדיקת ספין-דאון להטמעת אורגנואידים תלת-ממדיים של סרטן הערמונית באגרוז. אורגנואידים משובצים אלה יכולים לשמש לניתוח היסטופתולוגי נוסף כדי לחקור צמיחה והתפתחות סרטן.

פרוטוקול

1. עיבוד אורגנואידים להיסטולוגיה: שיטת הספין דאון של אגרוז

הערה: פרוטוקול זה מעובד מפרסום קודם של Vlachogiannis et al. הוספנו שלב של הטמעת אגרוז כדי להטמיע את כל אוכלוסיות האורגנואידים בהצלחה.

1. הסר מדיה קיימת מהבאר. היזהרו שלא לשאוף את כיפות קרום המרתף.
2. הוסף נפח שווה (שווה לנפח המדיה שהוסר משלב 1) של תמיסת שחזור התא ודגר במשך 60 דקות ב- 4 ° C.
3. עקרו את כיפת קרום המרתף באמצעות פיפטה ומעכו את כיפת קרום המרתף באמצעות קצה פיפטה. אספו את תמיסת שחזור הכיפה והתאים המנותקים בצינור של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה ב 300 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות.
5. הסר את supernatant (תמיסת שחזור תאים). שמור את כל supernatants בצינורות נפרדים עד הסוף, כאשר נוכחות של אורגנואידים מאושר בשלב הגלולה הסופית.
6. מוסיפים את הנפח הרצוי (טבלה 1) של PBS קר ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להפריע לגלולה באופן מכני.
7. צנטריפוגה ב 300 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות.
8. הסר את supernatant (PBS).
9. תקן את הגלולה בנפח תואם (למשל, 500 μL עבור גלולה אחת מתנאי תרבית צלחת 24 בארות, טבלה 1) של 4% PFA למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
10. לאחר הקיבוע, צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° C במשך 5 דקות.
11. הסר את supernatant (PFA).
12. יש לשטוף בנפח תואם (למשל, 500 מיקרוליטר לגלולה אחת ממצב תרבית צלחת 24 בארות, טבלה 1) של PBS וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
13. הכינו אגרוז חם (2% אגרוז ב-PBS).
    הערה: כאן, כדורי תא עבור חלקים קפואים ניתן להשעות ישירות ב 200 μL של תרכובת OCT.
14. להשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של agarose (2% PBS).
    1. מיד לאחר הוספת אגרוז, נתק בעדינות את גלולת התא מדופן הצינור של 1.5 מ"ל באמצעות מחט 25 גרם המחוברת למזרק 1 מ"ל. כפי שניתן לראות באיור 1, אם כדורית התא אינה מנותקת פיזית מהדופן של צינור 1.5 מ"ל, קיים סיכון לאבד את כל או חלק מכדורית התא במהלך תהליך הטבעה של אגרוז.
15. חכו עד שה-2% ב-PBS יתגבשו לחלוטין.
16. נתק את גוש האגרוז המוצק מצינור 1.5 מ"ל באמצעות מחט 25 גרם המחוברת למזרק 1 מ"ל.
17. מעבירים את גוש האגרוז המנותק המכיל את גלולת התא לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
18. מלאו את הצינורית ב-70% EtOH והמשיכו הלאה באמצעות הפרוטוקול הקונבנציונלי להתייבשות רקמות והטבעה של פרפין.

טבלה 1: צפיפות זריעה, נפח קרום מרתף ונפח בינוני הדרושים לכיפה אחת

צלחת תרבות	צפיפות זריעה (תאים)	נפח קרום מרתף (μL)	בינוני (μL)
48 באר	25,000-50,000	20	250
24 באר	50,000-250,000	40	500
6 באר	50,000-250,000	40	2,000

תוצאות

איור 1: שלב מפתח להטמעת אגרוז מוצלחת. תהליך לניתוק גלולת התא מדופן הצינור בנפח 1.5 מ"ל.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל פיפטמן	גילסון	F123602
1 מ"ל מזרק	מזרק BD	329654
צינור 1.5 מ"ל	מוצרי Spectrum Lab	941-11326-ATP083
מחט 25 גרם	BD PrecisionGlide מחט	305122
4% פרפורמאלדהיד (PFA)	אלפא עזר	J61899
70% אתנול (EtOH)	VWR	BDH1164-4LP
אגרוז	לונזה	50000
צלחת תרבית תאים - 24 באר	כוכב משנה	3524
צלחת תרבית תאים - 48 באר	כוכב משנה	3548
צלחת תרבית תאים - 6 באר	כוכב משנה	3516
פתרון לדיסוציאציה של תאים, Accumax	Innovative Cell Technologies, Inc.	AM105
פתרון שחזור תאים	קורנינג	354253
מגרד תאים	זארשטדט	83.18
dPBS	קורנינג/סלגרו	21-031-CV
טיפים פיפטה עבור 1 מ"ל (טיפים כחולים)	פישרברנד רדי-טיפ	21-197-85
צנטריפוגת שולחן קטנה	תרמופישר סיינטיפיק	75002426
מתחם OCT	רקמות-טק	4583
אמבט מים	פישר סק	2320