Agarose Spin Down Assay: טכניקה להטמעת אורגנואידים לניתוח היסטולוגי

1. עיבוד אורגנואידים להיסטולוגיה: שיטת הספין דאון של אגרוז

הערה: פרוטוקול זה מעובד מפרסום קודם של Vlachogiannis et al. הוספנו שלב של הטמעת אגרוז כדי להטמיע את כל אוכלוסיות האורגנואידים בהצלחה.

1. הסר מדיה קיימת מהבאר. היזהרו שלא לשאוף את כיפות קרום המרתף.
2. הוסף נפח שווה (שווה לנפח המדיה שהוסר משלב 1) של תמיסת שחזור התא ודגר במשך 60 דקות ב- 4 ° C.
3. עקרו את כיפת קרום המרתף באמצעות פיפטה ומעכו את כיפת קרום המרתף באמצעות קצה פיפטה. אספו את תמיסת שחזור הכיפה והתאים המנותקים בצינור של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה ב 300 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות.
5. הסר את supernatant (תמיסת שחזור תאים). שמור את כל supernatants בצינורות נפרדים עד הסוף, כאשר נוכחות של אורגנואידים מאושר בשלב הגלולה הסופית.
6. מוסיפים את הנפח הרצוי (טבלה 1) של PBS קר ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי להפריע לגלולה באופן מכני.
7. צנטריפוגה ב 300 x גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות.
8. הסר את supernatant (PBS).
9. תקן את הגלולה בנפח תואם (למשל, 500 μL עבור גלולה אחת מתנאי תרבית צלחת 24 בארות, טבלה 1) של 4% PFA למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
10. לאחר הקיבוע, צנטריפוגה ב 300 x g ו 4 ° C במשך 5 דקות.
11. הסר את supernatant (PFA).
12. יש לשטוף בנפח תואם (למשל, 500 מיקרוליטר לגלולה אחת ממצב תרבית צלחת 24 בארות, טבלה 1) של PBS וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
13. הכינו אגרוז חם (2% אגרוז ב-PBS).
    הערה: כאן, כדורי תא עבור חלקים קפואים ניתן להשעות ישירות ב 200 μL של תרכובת OCT.
14. להשעות מחדש את גלולת התא ב 200 μL של agarose (2% PBS).
    1. מיד לאחר הוספת אגרוז, נתק בעדינות את גלולת התא מדופן הצינור של 1.5 מ"ל באמצעות מחט 25 גרם המחוברת למזרק 1 מ"ל. כפי שניתן לראות באיור 1, אם כדורית התא אינה מנותקת פיזית מהדופן של צינור 1.5 מ"ל, קיים סיכון לאבד את כל או חלק מכדורית התא במהלך תהליך הטבעה של אגרוז.
15. חכו עד שה-2% ב-PBS יתגבשו לחלוטין.
16. נתק את גוש האגרוז המוצק מצינור 1.5 מ"ל באמצעות מחט 25 גרם המחוברת למזרק 1 מ"ל.
17. מעבירים את גוש האגרוז המנותק המכיל את גלולת התא לצינור חדש של 1.5 מ"ל.
18. מלאו את הצינורית ב-70% EtOH והמשיכו הלאה באמצעות הפרוטוקול הקונבנציונלי להתייבשות רקמות והטבעה של פרפין.

טבלה 1: צפיפות זריעה, נפח קרום מרתף ונפח בינוני הדרושים לכיפה אחת

איור 1: שלב מפתח להטמעת אגרוז מוצלחת. תהליך לניתוק גלולת התא מדופן הצינור בנפח 1.5 מ"ל.