בדיקת אורגנואיד ערמונית: טכניקת תרבית Ex Vivo מבוססת טבעת ג'ל מטריקס לחקר יכולת ההתמיינות של תאי אפיתל הערמונית

תקציר

מקור: Crowell, P. D. et al. הערכת יכולת ההתמיינות של תאי אפיתל ערמונית עכבר באמצעות תרבית אורגנואידים. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הטיפוח של תאי אפיתל ערמונית עכבר מבודדים באמצעות טכניקת תרבית מבוססת טבעת ג'ל מטריצה. גישה זו יכולה לספק מידע משלים על יכולת ההתמיינות של תאי אפיתל הערמונית ליצור מבנים בלוטיים תלת-ממדיים בתגובה למניפולציה גנטית או פרמקולוגית.

פרוטוקול

1. ציפוי תאי אפיתל ערמונית ממוינים לתרבית אורגנואיד ראשונית של עכבר — תזמון: 2-3 שעות (לא כולל הכנת צלחת מצופה Poly-HEMA)

הערה: לוחות מצופים ב- Poly-HEMA כדי למנוע היווצרות מושבה דו-ממדית על פני השטח של הבאר מתחת לג'ל המטריצה. הכינו צלחות מצופות Poly-HEMA יום אחד לפני ציפוי, תאי אפיתל ערמונית בזאליים או לומינליים ממוינים לתרבית אורגנואידים של עכבר. הפשירו 1 מ"ל אליציטוטים של ג'ל מטריצת גורם גדילה מופחת, המכונה להלן ג'ל מטריצה, על קרח 2 שעות לפני שלב 1.1. Y-27632 (מעכב ROCK) יש להוסיף למדיית אורגנואיד עכבר מיד לפני שלב 1.1. בצע את שלבים 1.1-1.8 על קרח.

1. משחררים את התאים בצינורות עגולים בעלי תחתית עגולה של 5 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ושאפו את הסופרנטנט.
2. שטפו את גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של מדיה אורגנואידית של עכבר (טבלה 1).
3. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant.
4. השהיה מחדש במדיה אורגנואידית של עכבר בצפיפות תאים של 1,000 תאים/μL.
5. להכנת תערובות אב, ערבבו תאי אפיתל המרחפים במדיה אורגנואידית של עכבר עם ג'ל מטריצה ליצירת תערובת סופית המכילה 25% תאים/מדיה ו-75% ג'ל מטריצה. תאי בסיס מצופים בדרך כלל בריכוז של 100-2,000 תאים / 80 μL, בעוד שתאים לומינליים מצופים בדרך כלל בריכוז של 2,000-10,000 תאים / 80 μL. צפיפות התאים המצופים משתנה בהתאם ליום איסוף החומרים הצפוי וליישום הרצוי במורד הזרם.
   הערה: יש לצנן שפופרות בגודל מתאים לקבלת נפח תערובת האב הצפוי 5 דקות לפני הכנת תערובת האב. כדי להבטיח שג'ל המטריצה לא יתקשה בזמן הטיפול, חשוב לקרר את קצה הפיפטה על ידי פיפטינג ג'ל המטריצה 3-4 פעמים לפני העברתו לצינור חדש.
6. הוסף 80 μL של תערובת ג'ל מטריצה / תאים לכל באר של צלחת 24 באר. מומלץ להצמיד טיפה לחצי התחתון של דופן הבאר, תוך הימנעות ממגע ישיר עם ציפוי Poly-HEMA. לאחר הוספת ג'ל המטריצה, מערבלים את הצלחת כדי לאפשר לתערובת ג'ל המטריצה/תאים ליצור טבעת סביב שפת הבאר.
7. הניחו את הצלחת בעלת 24 הבארות לתוך אינקובטור 37°C 5% CO₂ בצד ימין למשך 10 דקות כדי לאפשר לג'ל המטריקס להתקשות חלקית.
   הערה: התחל לחמם מדיה אורגנואיד עכבר ב 37 ° C מיד לאחר הנחת צלחת 24 בארות באינקובטור.
8. לאחר הדגירה במשך 10 דקות, הופכים את הצלחת בת 24 הבארות ודוגרים במשך 50 דקות נוספות כדי לאפשר לג'ל המטריקס להתקשות לחלוטין.
9. הוסף 350 μL של מדיה אורגנואיד עכבר שחומם מראש טיפה למטה למרכז כל באר.
   הערה: כדי לשמור על שלמות ג'ל המטריצה, חשוב להימנע מטבעת ג'ל המטריצה בעת הוספת מדיה.
10. לאחר הוספת המדיה, להחזיר את צלחת 24 באר 37 ° C 5% CO₂ אינקובטור.

2. חידוש מדיה אורגנואיד עכבר — תזמון: 10-15 דקות לכל צלחת של 24 בארות

הערה: יש להחליף מדיה קיימת במדיה חדשה כל 48 שעות. לפני כל שינוי מדיה, יש לחמם מראש את המדיה האורגנואידית של העכבר. אין צורך להוסיף מעכב ROCK למדיה המשמשת לחידוש.

1. הטה את צלחת 24 הקידוחים בזווית של 45° והסר בעדינות מדיה קיימת ממרכז כל באר באמצעות פיפטה P1000 תוך הימנעות מטבעת ג'ל המטריצה.
2. הוסף 350 μL של מדיה אורגנואיד עכבר שחומם מראש כמו בשלב 1.9. מומלץ להוסיף נפח גדול יותר של מדיה (עד 1 מ"ל) לאורגנואידים בתרבית במשך יותר מ -5 ימים כדי למנוע דלדול מהיר של חומרים מזינים מרכזיים וגורמי גדילה.

טבלה 1: הוראות להכנת מדיה אורגנואידית עכבר

רכיב	ריכוז
B-27	1x (לדלל מתרכיז פי 50)
גלוטמקס	1x (לדלל מתרכיז פי 100)
N-אצטיל-L-ציסטאין	1.25 מ"מ
נורמוצין	50 מיקרוגרם/מ"ל
EGF אנושי רקומביננטי, ללא בעלי חיים	50 נ"ג/מ"ל
נוגין אנושי רקומביננטי	100 ננוגרם/מ"ל
R-spondin 1-מותנה מדיה	10% מדיה מותנית
א83-01	200 נאנומטר
DHT	1 נאנומטר
Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב סלעים)	10 מיקרומטר
DMEM/F-12 מתקדם	מדיה בסיסית
R-spondin 1-conditioned media נוצר כמתואר ב- Drost et al. לאחר הוספת כל הרכיבים, סנן את מדיית האורגנואיד של העכבר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. מעכב ROCK מתווסף רק במהלך הקמת תרבות והעברת אורגנואידים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא	F8667
תוסף B-27 (50x), ללא סרום	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044
DMEM/F-12 מתקדם	תרמו פישר סיינטיפיק	12634010
צלחת μ 35 מ"מ, גבוהה	איבידי	81156
מטריג'ל מטריצת ממברנות GFR	קורנינג	CB-40230C
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U / מ"ל)	תרמו פישר סיינטיפיק	15-140-122
פולי(2-הידרוקסיאתיל מתקרילט) (Poly-HEMA)	סיגמא	P3932-25G
Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב סלעים)	סלק כימיקלים	S1049-50MG
א83-01	טוקריס	2939
(דיהידרו)טסטוסטרון (5αAndrostan-17β-ol-3-one)	סיגמא	A-8380
גלוטמקס	תרמו פישר סיינטיפיק	35050061
נורמוצין	תרמו פישר סיינטיפיק	ANT-NR-1
EGF אנושי רקומביננטי, ללא בעלי חיים	פפרוטק	AF-100-15
נוגין אנושי רקומביננטי	פפרוטק	120-10 מעלות צלזיוס
RPMI 1640 בינוני, HEPES (CS של 10)	תרמו פישר סיינטיפיק	22400105
עצור מעכב phosphatase	תרמו פישר סיינטיפיק	78428
קוקטייל מעכב פרוטאז מלא	סיגמא	11836145001
טריטון X-100	סיגמא	X100-5ML
סוניק דיסמברטור	תרמו פישר סיינטיפיק	FB120