מיצוי חלבון ליזט: טכניקה לליז אורגנואידים לאיסוף חלבונים תאיים

תקציר

מקור: Crowell, P. D. et al. הערכת יכולת ההתמיינות של תאי אפיתל ערמונית עכבר באמצעות תרבית אורגנואידים. J. Vis. Exp. (2019)

בסרטון זה, אנו מדגימים מיצוי של חלבונים ליזטים מאורגנואידים של הערמונית בתרבית בטבעת מטריצת קרום מרתף. ניתוח של שברי החלבונים שחולצו יכול לעזור לחקור את ביטוי סמן השושלת באורגנואידים.

פרוטוקול

1. מיצוי חלבון ליזט מאורגנואידים של הערמונית לניתוח כתמים מערביים — תזמון: 2.5-4 שעות

הערה: לפני איסוף אורגנואידים למיצוי חלבונים ליזט, הכינו וחיממו מראש מדיה המכילה דיפאז (טבלה 1).

1. הסר את המדיה מכל באר על ידי הטיית צלחת 24 הקידוחים בזווית של 45° והסרה עדינה של המדיה הקיימת ממרכז כל באר באמצעות פיפטה P1000 תוך הימנעות מטבעת ג'ל המטריצה.
2. כדי לאסוף אורגנואידים, פוצצו שוב ושוב את ג'ל המטריקס על ידי פיפטציה של 1 מ"ל של מדיה המכילה חומרים שונים ישירות על טבעת ג'ל המטריקס עד שכל הטבעת נעקרה, והעבירו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   הערה: חשוב להימנע ממגע ישיר עם הבארות מצופות Poly-HEMA. מגע ישיר עלול לגרום לזיהום של החומר שנאסף עם Poly-HEMA, אשר עלול להשפיע לרעה על הישרדות התא.
3. מניחים את צינור(י) המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לתוך אינקובטור של 37°C 5% CO₂ למשך 30 דקות עד שעה כדי לאפשר עיכול מלא של ג'ל המטריצה על ידי פיזור.
4. הורידו את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה במהירות של 800 x גרם למשך 5 דקות ב-RT והוציאו את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה.
5. הוסף מי מלח חוצצי פוספט (PBS) לגלולת האורגנואיד והשהה מחדש על ידי תנועה עדינה.
   הערה: אי השעיה מספקת של כדורית האורגנואיד עלולה לגרום לזיהום של חומר אורגנואידי עם שאריות dispase או ג'ל מטריצה.
6. פלטו את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant באמצעות micropipette.
7. הקפיאו במהירות את כדורי האורגנואיד על ידי הכנסת כל צינור לתמיסה המכילה קרח יבש ומתנול. אחסנו את הצינור(ות) עד לשימוש עתידי בטמפרטורה של -80°C. לחלופין, חלצו חלבון ליזט מיד לאחר שלב 1.6.
8. השהה מחדש את כדורי האורגנואיד ב-100 מיקרוליטר של חיץ ליזה חלבוני (טבלה 1) לכל 10 מיקרוליטר של נפח תא ארוז. החלק כדי להשהות מחדש.
   הערה: אם יש צורך בחידוש לאחר הקפאה מהירה, יש לוודא שמאגר הליזה של החלבון מופשר לפני הסרת הדגימות מ-80°C-, מכיוון שיש להוסיף חיץ ליזה לדגימות באופן מיידי כדי למנוע פעילות פוספטאז ופרוטאז.
9. לדגור על הדגימות בחיץ ליזה חלבוני על קרח למשך 45 דקות לפחות
   הערה: מומלץ לבצע סוניקט לפני הדגירה על קרח כדי להגביר את יעילות התאוששות החלבון הגרעיני; עם זאת, סוניקציה אינה נדרשת. אם סוניקציה אינה מבוצעת, המשך לשלב 1.10.
   1. כדי להסוניק, יש לטבול צינורות בקרח רטוב ולמרוח בעדינות את קצה המפרק הקולי על צינור המיקרוצנטריפוגה. סוניק במשך 40 שניות ב-20 קילוהרץ.
10. המשך לכתם מערבי בעקבות פרוטוקולים מבוססים.

טבלה 1: הוראות להכנת פתרונות מרכזיים

מתכונים
מדיה המכילה דיספאז	1 מ"ג / מ"ל dispase + 10 μM מעכב ROCK ב DMEM F12 מתקדם. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
מדיה דיסוציאציה	10% FBS + 1x פניצילין-סטרפטומיצין בסל"ד 1640. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
חיץ חלבון ליזה	מאגר RIPA + מעכבי פוספטאז + מעכבי פרוטאז
פתרון חסימה	10% FBS ב-PBS עם 0.2% Triton X-100

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
א83-01	טוקריס	2939
DMEM/F-12 מתקדם	תרמו פישר סיינטיפיק	12634010
תוסף B-27 (50x), ללא סרום	תרמו פישר סיינטיפיק	17504044
Dispase II, אבקה	תרמו פישר סיינטיפיק	17-105-041
סרום בקר עוברי (FBS)	סיגמא	F8667
GlutaMAX Thermo	פישר סיינטיפיק	35050061
עצור מעכב phosphatase	תרמו פישר סיינטיפיק	78428
מטריג'ל מטריצת ממברנות GFR	קורנינג CB-	40230ג
N-אצטיל-L-ציסטאין	סיגמא	A9165
נורמוצין	תרמו פישר סיינטיפיק	ANT-NR-1
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ מ"ל)	תרמו פישר סיינטיפיק	15-140-122
פולי(2-הידרוקסיאתיל מתקרילט) (פולי-HEMA)	סיגמא	P3932-25G
Radioimmunoprecipitation assay (קרית שמונה)	תרמו פישר סיינטיפיק	PI89901
רקומביננטי אנושי EGF, ללא בעלי חיים	פפרוטק	AF-100-15
נוגין אנושי רקומביננטי	פפרוטק	120-10 מעלות צלזיוס
RPMI 1640 בינוני, HEPES (CS של 10)	תרמו פישר סיינטיפיק	22400105
סוניק דיסמברטור	תרמו פישר סיינטיפיק	FB120
טריטון X-100	סיגמא	X100-5ML
Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב סלעים)	סלק כימיקלים	S1049-50MG