מיצוי חלבון ליזט: טכניקה לליז אורגנואידים לאיסוף חלבונים תאיים

1. מיצוי חלבון ליזט מאורגנואידים של הערמונית לניתוח כתמים מערביים — תזמון: 2.5-4 שעות

הערה: לפני איסוף אורגנואידים למיצוי חלבונים ליזט, הכינו וחיממו מראש מדיה המכילה דיפאז (טבלה 1).

1. הסר את המדיה מכל באר על ידי הטיית צלחת 24 הקידוחים בזווית של 45° והסרה עדינה של המדיה הקיימת ממרכז כל באר באמצעות פיפטה P1000 תוך הימנעות מטבעת ג'ל המטריצה.
2. כדי לאסוף אורגנואידים, פוצצו שוב ושוב את ג'ל המטריקס על ידי פיפטציה של 1 מ"ל של מדיה המכילה חומרים שונים ישירות על טבעת ג'ל המטריקס עד שכל הטבעת נעקרה, והעבירו לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
   הערה: חשוב להימנע ממגע ישיר עם הבארות מצופות Poly-HEMA. מגע ישיר עלול לגרום לזיהום של החומר שנאסף עם Poly-HEMA, אשר עלול להשפיע לרעה על הישרדות התא.
3. מניחים את צינור(י) המיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל לתוך אינקובטור של 37°C 5% CO₂ למשך 30 דקות עד שעה כדי לאפשר עיכול מלא של ג'ל המטריצה על ידי פיזור.
4. הורידו את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה במהירות של 800 x גרם למשך 5 דקות ב-RT והוציאו את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה.
5. הוסף מי מלח חוצצי פוספט (PBS) לגלולת האורגנואיד והשהה מחדש על ידי תנועה עדינה.
   הערה: אי השעיה מספקת של כדורית האורגנואיד עלולה לגרום לזיהום של חומר אורגנואידי עם שאריות dispase או ג'ל מטריצה.
6. פלטו את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב RT ולהסיר את supernatant באמצעות micropipette.
7. הקפיאו במהירות את כדורי האורגנואיד על ידי הכנסת כל צינור לתמיסה המכילה קרח יבש ומתנול. אחסנו את הצינור(ות) עד לשימוש עתידי בטמפרטורה של -80°C. לחלופין, חלצו חלבון ליזט מיד לאחר שלב 1.6.
8. השהה מחדש את כדורי האורגנואיד ב-100 מיקרוליטר של חיץ ליזה חלבוני (טבלה 1) לכל 10 מיקרוליטר של נפח תא ארוז. החלק כדי להשהות מחדש.
   הערה: אם יש צורך בחידוש לאחר הקפאה מהירה, יש לוודא שמאגר הליזה של החלבון מופשר לפני הסרת הדגימות מ-80°C-, מכיוון שיש להוסיף חיץ ליזה לדגימות באופן מיידי כדי למנוע פעילות פוספטאז ופרוטאז.
9. לדגור על הדגימות בחיץ ליזה חלבוני על קרח למשך 45 דקות לפחות
   הערה: מומלץ לבצע סוניקט לפני הדגירה על קרח כדי להגביר את יעילות התאוששות החלבון הגרעיני; עם זאת, סוניקציה אינה נדרשת. אם סוניקציה אינה מבוצעת, המשך לשלב 1.10.
   1. כדי להסוניק, יש לטבול צינורות בקרח רטוב ולמרוח בעדינות את קצה המפרק הקולי על צינור המיקרוצנטריפוגה. סוניק במשך 40 שניות ב-20 קילוהרץ.
10. המשך לכתם מערבי בעקבות פרוטוקולים מבוססים.

טבלה 1: הוראות להכנת פתרונות מרכזיים