$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. תיקון והכתמת אורגנואידים של הערמונית לניתוח אימונוהיסטוכימי על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי שלם
- איסוף אורגנואידים של הערמונית מצלחות 24 בארות — תזמון: 45-60 דקות
הערה: בעת איסוף אורגנואידים של הערמונית לעיבוד עבור מיקרוסקופ קונפוקלי, זה קריטי לטפל בהם בזהירות על מנת לשמור על המבנה שלהם. פרוטוקול האיסוף להלן נועד להפחית את השיבוש במבנה האורגנואידים במהלך הבידוד.
- הסר את המדיה מכל באר של הצלחת המכילה אורגנואידים על ידי הטיית הצלחת בזווית של 45°.
- עיכלו את ג'ל המטריצה על ידי דגירה שלו עם 500 μL של מדיה המכילה חומרים נפרדים (טבלה 1) למשך 30 דקות באינקובטור של 37°C 5% CO2.
- אספו את תרחיף האורגנואידים המעוכל בצינור מיקרוצנטריפוגה ושחררו את האורגנואידים באמצעות צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב- RT. הסר את הסופרנאטנט.
- צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של אורגנואידים בערמונית — תזמון: 3-4 ימים (1-5 שעות ביום)
- הוסף 500 μL של 4% paraformaldehyde ב- PBS ודגר במשך שעתיים ב- RT עם רעד עדין.
- גלול את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 3 דקות ב RT, להסיר את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של PBS במשך 15 דקות עם רעד עדין.
- שטפו את הגלולה כמו בשלב 1.2.2 פעמיים נוספות.
- משחררים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant. הוסף 1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI בתמיסת חסימה (טבלה 1). יש לדגור במשך שעתיים ב-RT או לחילופין ללילה ב-4°C עם רעידות עדינות.
- משחררים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant. יש להוסיף נוגדן ראשוני (ארנב אנטי-p63, עכבר אנטי-ציטוקרטין 8) בתמיסת חסימה ולדגור למשך הלילה ב-4°C עם רעידות עדינות.
- משחררים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant. לשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של PBS במשך 15 דקות עם רעד עדין.
- שטפו את הגלולה כמו בשלב 1.2.6 פעמיים נוספות.
- משחררים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant. הוסף נוגדן משני (עז נגד ארנב IgG-Alexa Fluor 594, עז נגד עכבר IgG-Alexa Fluor 488) בתמיסת חסימה ודגר לילה ב 4 ° C עם ניעור עדין.
- גלול את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 3 דקות ב RT, להסיר את supernatant, ולשטוף את הגלולה עם 1 מ"ל של PBS במשך 15 דקות עם רעד עדין.
- שטפו את הגלולה כמו בשלב 1.2.9 פעמיים נוספות.
2. ניקוי רקמות והרכבה של אורגנואידים מוכתמים של הערמונית למיקרוסקופ קונפוקלי בהרכבה מלאה — תזמון: 7 שעות
- משחררים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
- הוסף 1 מ"ל של 30% סוכרוז ב- PBS עם 1% Triton X-100 ודגור במשך שעתיים ב- RT עם רעד עדין.
- משחררים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
- הוסיפו 1 מ"ל של 45% סוכרוז ב-PBS עם 1% Triton X-100 ודגרו במשך שעתיים ב-RT עם רעידות עדינות.
- משחררים את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 3 דקות ב RT ולהסיר את supernatant.
- הוסיפו 1 מ"ל של 60% סוכרוז ב-PBS עם 1% Triton X-100 ודגרו במשך שעתיים ב-RT עם רעידות עדינות.
- גלול את האורגנואידים על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 3 דקות ב RT ולהסיר 95% של supernatant.
הערה: הגלולה הופכת רופפת יותר ככל שריכוז הסוכרוז הופך גבוה יותר. מומלץ להתבונן באורגנואידים המוכתמים ב-DAPI תחת אור העל-סגול כדי לוודא שהם לא אבדו במהלך הסרת הסופרנאטנט.
- מעבירים טיפה של 10-20 מיקרוליטר של המתלה הנותר לכיסוי קאמרי וממשיכים למיקרוסקופ קונפוקלי.
הערה: ניתן למקם שברי כיסוי משני צדי הטיפה כדי שישמשו כספייסרים (איור 1C). אלה מונעים מאורגנואידים לקרוס כאשר מניחים כיסוי מעל הטיפה.
טבלה 1: הוראות להכנת פתרונות מרכזיים
| רכיב | ריכוז |
| B-27 | 1x (לדלל מתרכיז פי 50) |
| גלוטמקס | 1x (לדלל מתרכיז פי 100) |
| N-אצטיל-L-ציסטאין | 1.25 מ"מ |
| נורמוצין | 50 מיקרוגרם/מ"ל |
| EGF אנושי רקומביננטי, ללא בעלי חיים | 50 נ"ג/מ"ל |
| נוגין אנושי רקומביננטי | 100 ננוגרם/מ"ל |
| R-spondin 1-מותנה מדיה | 10% מדיה מותנית |
| א83-01 | 200 נאנומטר |
| DHT | 1 נאנומטר |
| Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב סלעים) | 10 מיקרומטר |
| DMEM/F-12 מתקדם | מדיה בסיסית |
| R-spondin 1-conditioned media נוצר כמתואר Drost, et al. לאחר הוספת כל הרכיבים, סנן את מדיית האורגנואיד של העכבר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. מעכב ROCK מתווסף רק במהלך הקמת תרבות והעברת אורגנואידים. |
