בידוד תאי מטרה מבוסס חוט פונקציונלי: טכניקת Ex Vivo לבידוד תאים סרטניים מדם היקפי קוצני

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי HT-29 (קו תאי סרטן המעי הגס האנושי) מ-PBS או מתערובות מלאכותיות של תאי HT-29 ודם היקפי. אותו ניסוי בוצע עם שני קווי תאים נוספים (LNCaP ו-VCaP) וניתן תיאורטית לבצעו עם כל התאים המבטאים EpCAM.

1. הכנת תאי יעד

1. תרבית תאים ותיוג תאים
   הערה: בפרוטוקול זה, תאים מתורבתים בצלוחיות תרבית בגודל 75 סמ"ר. אנא התאימו את כמויות הריאגנטים בהתאם אם נעשה שימוש במכשירי תרבית תאים אחרים (למשל, צלחות תרבית בגודל 25 סמ"ר, צלחות 6 בארות וכו'). כל הנוזלים המשמשים מחוממים מראש ל -37 מעלות צלזיוס באמבט מים. אם לא צוין אחרת, כל שלבי הפרוטוקול מבוצעים בטמפרטורת החדר (RT).
   1. תרבית תאי HT-29 במדיום 5a Modified Medium של McCoy בתוספת 2 mM L-גלוטמין, 20 mM Hepes, 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין ב-37°C באטמוספירה של 5% CO₂.
   2. כאשר התאים הם 90% confluent, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x PBS.
   3. כדי לקצור תאים, הוסף 2 מ"ל של תמיסת ניתוק התאים (טבלה של חומרים וריאגנטים) לתאים ודגר על התאים במשך כ -5 דקות ב 37 ° C.
      הערה: תמיסת הניתוק מכילה אנזימים מפרקי חלבון וקולגנוליטיים ב-1x PBS, 0.5 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ו-3 מ"ג/ליטר פנול אדום. צמצם את זמן החימום מראש של תמיסת ניתוק התא למינימום מכיוון שהיא לא תהיה פעילה לאחר שעה אחת ב- 37 מעלות צלזיוס. כסה את כל שכבת התא כדי להשיג ניתוק תאים אופטימלי.
   4. בדוק את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך.
   5. העבר את כל התאים המנותקים לצינור של 50 מ"ל מלא מראש ב- 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים (זהה לשימוש בשלב 1.1.1.) והשהה מחדש את התאים על ידי צנרת.
   6. הניחו את מתלה התאים הנותר על מערבל רולר אופקי ב-RT והמשיכו לשלב התווית.
2. תיוג תאים חיים של תאי יעד
   1. לדלל 1 μL של 5 mM CFSE (מסופק dimethyl sulfoxide, DMSO) ב 1 מ"ל של 1x PBS מחומם מראש ב 37 ° C כדי לקבל 5 מיקרומטר מוכן לשימוש CFSE תמיסה.
      הערה: לקבלת תוצאות צביעה מיטביות, השתמשו בתמיסות טריות.
   2. הכינו תמיסת צביעת DNA מוכנה לשימוש (טבלת חומרים וריאגנטים) ב-PBS 1x ואחסנו אותה בטמפרטורה של 2-6°C המוגנת מפני אור.
      הערה: לקבלת תוצאות צביעה מיטביות, השתמשו בתמיסות טריות.
   3. קבל את התאים ממערבל הרולר האופקי (שלב 1.1.6.) ושחרר את התאים ב 300 x גרם למשך 10 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את התאים ב 10 מ"ל של 1x PBS.
   4. שטפו שוב את התאים עם 1x PBS והשהו מחדש את כדורית התא בתמיסת תיוג CFSE מוכנה לשימוש של 500 μL.
   5. לדגור על התאים ב 37 ° C במשך 15 דקות ולאסוף את התאים לאחר צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות.
   6. להשהות מחדש את התאים המסומנים ב 1 מ"ל של מדיום תרבית תאים שחומם מראש ולאפשר לתאים להתחדש ב 37 ° C במשך 30 דקות.
   7. קצרו את התאים באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 3 דקות והשהו מחדש את כדורי התא ב -1 מ"ל של תמיסת צביעת DNA מוכנה לשימוש ב -37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   8. גלולה את התאים, להסיר את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים ב 4 מ"ל של 1x PBS. העריכו את צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר ובדקו אם יש תיוג פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ו-fluorescein isothiocyanate (FITC) (איור 1A ו-1E).
   9. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 3 דקות והשעו מחדש את גלולת התא בהתאם לצפיפויות התאים הדרושות לניסוי המתאים כפי שמוצג בסעיף הבא והניחו על קרח.

2. טעינת החוט

הערה: ניתן לבודד תאים מקופיצים של תאי מטרה/דם היקפיים בקנה מידה מיליליטר או על ידי מתן מספר נמוך של תאים בקנה מידה מיקרוליטרי. בעוד שהגישה הראשונה מאפשרת לחקות מצבים של תאים נדירים בדם היקפי, הגישה השנייה עשויה להיות הדרך המועדפת לחבר כמה תאים לצורך אופטימיזציה / בדיקה של פרוטוקול.

1. טעינת החוט באמצעות נפח גדול של מתלים סלולריים
   1. הכן פתרון חסימת BSA 2% על ידי המסת 0.8 גרם BSA ב 40 מ"ל של 1x PBS (שימוש בתרבית תאים). ממיסים BSA על ידי מערבולות ראשוניות ולאחר מכן דגירה ב-RT על מערבל רולר אופקי למשך 10-20 דקות.
   2. יש לשטוף שפופרות EDTA ריקות/צינורות נתרן הפרין עם 2 מ"ל של 2% BSA כדי להסיר שאריות נוגדות קרישה ולהשליך את התמיסה. חסום את משטח הצינור על ידי דגירה ב- RT עם 5 מ"ל של 2% BSA על מערבל רולר אופקי ב- 15 סל"ד למשך 30 דקות והשלך את התמיסה.
   3. לדלל תאים מסומנים (סעיף 1.2.) לצפיפות של 100,000 תאים/מ"ל ולהשתמש ב- 5 מ"ל לטעינת החוט.
   4. הוסף 5 מ"ל של תרחיף התאים המסומן (500,000 תאים בסך הכל) לצינור. הימנע מבועות בעת הוספת מתלה התא.
   5. הסירו את החוט מתא האחסון, כמו גם את מכסה הגומי שמחזיק את החוט, ושטפו אותו ב-1x PBS (איור 2).
   6. חדור את מכסה צינור הגומי של צינור ה- EDTA (שלב 2.1.4.) בעזרת מחט מזרק (20 גרם) והכנס את החוט כך שהחלק הפונקציונלי יהיה שקוע במלואו בתרחיף התא כאשר הפקק חוזר לצינור והצינור מונח על מערבל הרולר המוטה .
      הערה: החלק הפונקציונלי המשולש של החוט צריך להיות מכוסה במתלה תאים לאורך כל הטעינה.
   7. סובבו את הצינורות במערבל רולר מוטה במהירות 5 סל"ד למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתחבר לחוט.
   8. שטפו את החוט עם 5 מ"ל 1x PBS ואחסנו אותו בחושך ב 2-6 °C בצינור 15 מ"ל המכיל 1x PBS עד בדיקה חזותית.
      הערה: החלק התפקודי של החוט חייב תמיד להיות שקוע ב- PBS כדי למנוע פגיעה בתאים.
2. בידוד תאי מטרה מתערובות מלאכותיות עם דם היקפי (שיטת טעינה חלופית ל: 2.1. טעינת החוט באמצעות נפח גדול של מתלים סלולריים)
   1. לדלל תאים מסומנים (סעיף 1.2.) כדי לקבל תרחיפים של תאים עם צפיפות תאים גבוהה (> 1,000,000 תאים / מ"ל), ובכך לשמור על נפח תרחיף התא שנוסף לדם ההיקפי נמוך.
   2. הוסף 500 עד 500,000 תאים ל -5 מ"ל של דם היקפי וערבב אותם על ידי היפוך הצינור.
   3. הסר את החוט מתא האחסון, הסר את מכסה הגומי המחזיק את החוט ושטוף אותו ב- 1x PBS.
   4. חודרים למכסה צינור חדש עם החלק הלא פונקציונלי של המכשיר באמצעות מחט מזרק (20 גרם) כך שהחלק הפונקציונלי שקוע במלואו בדם הקוצני כאשר הפקק חוזר לצינור והצינור מונח על מערבל הרולר המוטה.
      הערה: החלק הפונקציונלי המשולש של החוט צריך להיות מכוסה במתלה תאים לאורך כל הטעינה.
   5. דגרו את הצינור על מערבל הרולר המוטה ב-5 סל"ד למשך 30 דקות ב-RT.
   6. שטפו את החוט שלוש פעמים ב-1x PBS ואחסנו אותו בחושך בצינור 15 מ"ל המכיל 1x PBS עד לבדיקה חזותית.
      הערה: החלק התפקודי של החוט חייב תמיד להיות שקוע כדי למנוע פגיעה בתאים.
3. טעינת החוט מתלי תאים בנפח נמוך (שיטת טעינה חלופית ל: 2.1. טעינת החוט באמצעות נפח גדול של מתלים סלולריים)
   1. השהה מחדש את התאים המסומנים ב- 1,000,000 תאים/מ"ל ב- 1x PBS.
   2. מקבעים פיפטה חד פעמית מזכוכית פסטר בקוטר 150 מ"מ בצורה אופקית על מתלה.
   3. הסירו את החוט מתא האחסון, אך השאירו את מכסה הגומי הצהוב מחזיק את החוט.
   4. מניחים את החוט בפיפטה, כך שהחלק הפונקציונלי ממוקם בקצה פיפטת פסטר ולא נוגע בזכוכית.
      הערה: קצה החוט לא צריך לבלוט מתוך קצה פיפטה פסטר. הימנע מחיבור הקצה האחורי של קצה פיפטת פסטר כאשר מכסה הגומי מחזיק את החוט. אם הם מחוברים היטב, לא ניתן לטעון את מתלי התאים מהצד השני לתוך קצה הפיפטה.
   5. טען 15 μL של תרחיף התא לתוך קצה פיפטת פסטר המכסה את החלק הפונקציונלי של החוט.
   6. דוגרים על החוט למשך 10 דקות. מסובבים ידנית את קצה החוט/פיפטה של פסטר בכל דקה.
   7. הסר את החוט מקצה פיפטת פסטר, שטוף אותו ב 5 מ"ל של 1x PBS ואחסן אותו בחושך ב 2-6 ° C בצינור 15 מ"ל המכיל 1x PBS עד בדיקה חזותית.
      הערה: החלק התפקודי חייב תמיד להיות שקוע ב-1x PBS כדי למנוע פגיעה בתאים.

3. ספירת תאים על החוט

הערה: שמור תמיד את החלק הפונקציונלי של החוט שקוע ב- PBS 1x כדי למנוע פגיעה בתאים.

1. השתמש בעט שומן כדי לצייר אזור מלבן על שקופית זכוכית ולהוסיף 500 μL של 1x PBS.
2. כופפו את החלק הלא פונקציונלי של החוט והניחו אותו על מגלשת הזכוכית כך שהחלק הפונקציונלי יהיה שקוע ב- 1x PBS.
   הערה: התאם את שטח המלבן ואת נפח 1x PBS כדי לכסות לחלוטין את החלק הפונקציונלי של החוט. השתמש בסרט הדבקה דו-פרצופי כדי להרכיב את החלק הלא פונקציונלי של החוט על השקופית.
3. בדקו חזותית את שני צידי החוט כדי למנות את התאים שנלכדו (איור 1B ו-1F).
   הערה: נוכחות התאים נקבעת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במסננים עבור DAPI ו- FITC. ניתן לבדוק את שני צידי החוט ולהעריך את מספר התאים (עבור מספרי תאים גבוהים) או לספור אותו (אפשרי רק אם מספר נמוך של תאים מחובר לחוט). ניתן לדלג על שלב זה אם אין צורך בספירת תאים.
4. לאחר הסריקה, החזיר את החוט לצינור 15 מ"ל המכיל PBS 1x, אחסן את החוט בחושך.
   הערה: ניתן לחתוך את רוב החלק הלא פונקציונלי של החוט (כולל העיקול) ולהסיר את האחסון.

4. ניתוק והתאוששות של תאי מטרה

הערה: ניתוק התאים ייעשה תוך 4 שעות לאחר הבידוד.

1. יש להמיס 4 מ"ג של רכיב חיץ השחרור (טבלת חומרים וריאגנטים) למ"ל של PBS 1x ולסנן את התמיסה דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר כדי לקבל את המאגר המוכן לשימוש.
   הערה: הפולימר של החוט מורכב מהידרוג'ל אשר מתפקד עם נוגדנים אנטי-EpCAM המאפשרים קשירה לתאי מטרה מציגי EpCAM. מאגר השחרור מכיל אנזים פרוטאוליטי פחמן-חמצן המסוגל לבקע את ההידרוג'ל. שסע פרוטאוליטי גורם לפירוק הפולימר ובכך לניתוק התאים שנלכדו.
2. מחממים מראש את מאגר השחרור ב-37°C למשך 5 דקות.
3. הוסף 1.6 מ"ל של מאגר שחרור כדי למלא צינור תגובה של 1.5 מ"ל.
   הערה: צינורות המיועדים לנפחי תגובה של 1.5 מ"ל מאפשרים יישום של 1.6 מ"ל הדרוש להטמעת החלק הפונקציונלי של החוט.
4. יש לדגור על החלק הפונקציונלי של החוט במאגר השחרור בטמפרטורה של 37°C (אמבט מים) למשך 20 דקות. השתמש במכסה הגומי שנשלח עם החוט במקום במכסה הצינור כדי לקבע את החוט בצינור 1.5 מ"ל כדי למנוע זיהום במהלך הדגירה באמבט המים.
5. העבירו את מכלול החוט/צינור לשייקר ב-RT וב-500 סל"ד למשך 15 דקות.
   הערה: לשייקר מסלול של 1.5 מ"מ.
6. מניחים את מכלול החוט/צינור בצנטריפוגה ומסובבים אותו במהירות של 300 x גרם למשך 10 דקות.
7. הסר את החוט מהצינור, סגור את המכסה וצנטריפוגה את הצינור שוב ב 300 x גרם למשך 10 דקות.
   הערה: ניתן לאחסן את החוט ב-1x PBS בטמפרטורה של 2-6 מעלות צלזיוס בחושך לצורך ספירת תאים כדי להעריך את יעילות הניתוק/לבדוק תאים שנותרו על החוט.
8. כדי להקטין את נפח תרחיף התא, הסר את כל המיקרו-מניפולציה פרט ל-100 מיקרו-ליטר או לחילופין 300 מיקרו-ליטר (ציטוצנטריפוגה ומיקרודיסקציה בלייזר לאחר מכן) של הסופרנאטנט והמשך מיד לדגימה חד-תאית.

איור 1: תצוגה חזותית של תאים עם תווית.(A,E) תאים לפני טעינה: תאים מסומנים ב-CFSE ומוכתמים בצבע דנ"א המציג טווח של עוצמת אות CFSE (ירוק). (B,F) תאים מסומנים שנלכדו על החוט. (C,G) חוט לאחר הליך ניתוק תאים. (ד,ח) תאים מנותקים מחוט והתאוששו על ידי ציטוצנטריפוגה על מגלשה. CFSE: ערוץ FITC (ירוק). כתם DNA: ערוץ DAPI (כחול).

איור 2: איור 2: חוט ותא אחסון.(א) תאים של החוט. (ב) פירוט החלק המתפקד.