דגימת תא בודד באמצעות מיקרומניפולציה: טכניקה לבידוד תאים בודדים מתרחיף תאים סרטניים

תקציר

מקור: Chen S. et al. Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את הטכניקה לבידוד תאים בודדים ממאגר של תאי מטרה לביצוע אנליזה במורד הזרם. בשיטה זו, מיקרומניפולטור המותאם למיקרוסקופ משמש לבידוד מדויק של תא מטרה יחיד.

פרוטוקול

1. דגימה של תא בודד

1. מיקרומניפולציה
   הערה: כדי לאפשר יישומים במורד הזרם כמו ניתוח גנום שלם (WGA), תאים בודדים מבודדים יתווספו ל- 2 μL של תערובת אב ליזה של תאים. הכינו תערובת אב בהתאם למספר התאים שיש לעבד. חשב נפחים נוספים עבור אובדן עקב פיפטינג ומניחים את תערובת האב של ליזה התא על קרח.
   1. הכן תערובת אב ליזה של תאים (רכיבים של ערכת WGA, טבלת חומרים וריאגנטים). בקצרה, לערבב 2.0 μL של מאגר תגובה, 1.3 μL של octylphenoxypolyethoxyethanol (10% תמיסה), 1.3 μL של 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) פניל-פוליאתילן גליקול (10% תמיסה), 2.6 μL של תמיסת פרוטאינאז K, ו 12.8 μL RNase / מים נטולי DNase כדי לקבל תערובת אב עבור 10 דגימות (נפח כולל 20 μL).
      הערה: עבור דוגמאות נוספות, הגדל את אמצעי האחסון בהתאם.      
   2. השתמש בעט שומן כדי לצייר אזור המחזיק את מתלה התא במקומו. כוונן את השטח ואת עוצמת הקול אם צפיפות התא גבוהה מדי (כלומר, סמן שטח גדול יותר במגלשת הזכוכית, טען PBS 1x ואליציטוט של מתלה התא).
   3. פיפטה את כל מתלה תא המטרה על מגלשת הזכוכית.
   4. העבר את מגלשת הזכוכית למיקרוסקופ מצויד במיקרומניפולטור. תנו לתאים להסתפק במשך 5 דקות.
   5. הכינו צינורות PCR של 0.2 מ"ל עמוסים ב-2.0 מיקרוליטר של תערובת מאסטר ליזה של תאים (שהוכנו בשלב 1.1.1.) ואחסנו אותם על קרח.
   6. לאסוף תאים בודדים ב 1 μL של 1x PBS באמצעות micromanipulator ולהעביר את התאים לתוך צינור המכיל ליזה התא מאסטר mix.
      הערה: להעברת תאים שעברו מיקרומניפולציה לתוך מאגר הליזה של התא, מקמו את הנימים ישירות לתוך 2 מיקרוליטר של תמיסת ליזה ופלטו עד שניתן יהיה לראות בועות.
   7. סובב בקצרה את הדגימה במהירות של 2000 x גרם במשך 3 שניות באמצעות מיקרופוגה שולחנית כדי לאסוף את כל הנוזלים בתחתית הצינור. מניחים את הדגימות על קרח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח חוצץ פוספט (1x PBS)	תרמו פישר סיינטיפיק	10010-015
צינורות Vacutainer EDTA (או Na-heparin)	ב.ד.	366450 (או 366480)	משמש כצינור תגובה ללכידת ex vivo של תאי מטרה
פיפטות פסטר 150 מ"מ	וולאק	D810	משמש ליישום בנפח נמוך של תאים ל- C&R
עט גריז	דקו	S2002	משמש במגלשות זכוכית להחזקת מתלה התא במקומו
Axiovert M200 מצויד Mikromanipulator MMJ ו CellTram vario	Zeiss/Eppendorf		השתמש במיקרומניפולציה בהישג יד
מיקרו-נימים (קוטר 25 מיקרומטר), CustomTip Type I	אפנדורף	930001201	משמש למיקרומניפולציה של תאים
0.2 מ"ל צינורות PCR	ביואנזים	710920