דגימת תא בודד באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר: טכניקה לקצירת תאי מטרה מאוכלוסיית תאים הטרוגנית

1. דגימה של תא בודד

1. מיקרודיסקציה בלייזר
   הערה: תאים בודדים יתווספו ל- 4.5 μL של תערובת אב ליזה של תאים (רכיבים של ערכת WGA, טבלת חומרים וריאגנטים) עבור WGA.
   1. הכן את תערובת האב ליזה התא על פי Czyż et al. על ידי ערבוב 5.0 μL של חיץ תגובה, 1.3 μL של octylphenoxypolyethoxyethanol (10% תמיסה), 1.3 μL של 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (10% תמיסה), resp., 2.6 μL של תמיסת proteinase K ו 34.8 μL של מים נטולי RNase / DNase כדי לקבל תערובת אב עבור 10 דגימות (נפח כולל 45 μL). מניחים את תערובת האב על קרח.
      הערה: עבור דוגמאות נוספות, הגדל את אמצעי האחסון בהתאם.
   2. טיפול UV במגלשות מצופות קרום המתאימות למיקרודיסקציה בלייזר. הניחו את המגלשות במכשיר קרוסלינקר DNA וחשפו אותן לרמת ה-UV הגבוהה ביותר למשך כ-10 דקות.
   3. הרכיבו את המגלשה המצופה בקרום בציטוצנטריפוגה וציטוספין את כל מתלה התא ב 300 x גרם למשך 5 דקות.
      הערה: בעת שימוש במערכת בתוך נוזל, שבה התאים הם cytocentrifuge על המגלשה בתמיסה, להסיר את supernatant לאחר cytocentrifugation ולהחיל סיבוב יבש ב 1140 x גרם במשך 1 דקה.
   4. המשך ישירות למיקרודיסקציה בלייזר או תן לציטוספינים להתייבש באוויר למשך הלילה ולהקפיא את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
   5. פיפטה 4.5 μL של ליזה התא מאסטר לערבב לתוך מכסה של 0.2 מ"ל צינור PCR ולקצור תאים בודדים באמצעות microdissection לייזר.
   6. אחזר את צינור ה- PCR ממיקרוסקופ הלייזר וסגור את הצינור. אספו את כל הנוזלים בתחתית הצינור על ידי סיבוב קצר והניחו את הדגימה על קרח.
   7. המשך עם WGA תא יחיד או אחסן את הדגימות המבודדות ב -80 ° C למשך עד חודש אחד לפני עיבוד נוסף.