דגימת תא בודד באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר: טכניקה לקצירת תאי מטרה מאוכלוסיית תאים הטרוגנית

תקציר

מקור: Chen S. et al. Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את הטכניקה לקבלת תא בודד מאוכלוסיית תאים הטרוגנית באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר. התא המבודד היחיד יכול לשמש למחקרים גנומיים נוספים או לחקר הסרטן.

פרוטוקול

1. דגימה של תא בודד

1. מיקרודיסקציה בלייזר
   הערה: תאים בודדים יתווספו ל- 4.5 μL של תערובת אב ליזה של תאים (רכיבים של ערכת WGA, טבלת חומרים וריאגנטים) עבור WGA.
   1. הכן את תערובת האב ליזה התא על פי Czyż et al. על ידי ערבוב 5.0 μL של חיץ תגובה, 1.3 μL של octylphenoxypolyethoxyethanol (10% תמיסה), 1.3 μL של 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol (10% תמיסה), resp., 2.6 μL של תמיסת proteinase K ו 34.8 μL של מים נטולי RNase / DNase כדי לקבל תערובת אב עבור 10 דגימות (נפח כולל 45 μL). מניחים את תערובת האב על קרח.
      הערה: עבור דוגמאות נוספות, הגדל את אמצעי האחסון בהתאם.
   2. טיפול UV במגלשות מצופות קרום המתאימות למיקרודיסקציה בלייזר. הניחו את המגלשות במכשיר קרוסלינקר DNA וחשפו אותן לרמת ה-UV הגבוהה ביותר למשך כ-10 דקות.
   3. הרכיבו את המגלשה המצופה בקרום בציטוצנטריפוגה וציטוספין את כל מתלה התא ב 300 x גרם למשך 5 דקות.
      הערה: בעת שימוש במערכת בתוך נוזל, שבה התאים הם cytocentrifuge על המגלשה בתמיסה, להסיר את supernatant לאחר cytocentrifugation ולהחיל סיבוב יבש ב 1140 x גרם במשך 1 דקה.
   4. המשך ישירות למיקרודיסקציה בלייזר או תן לציטוספינים להתייבש באוויר למשך הלילה ולהקפיא את הדגימות ב -20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.
   5. פיפטה 4.5 μL של ליזה התא מאסטר לערבב לתוך מכסה של 0.2 מ"ל צינור PCR ולקצור תאים בודדים באמצעות microdissection לייזר.
   6. אחזר את צינור ה- PCR ממיקרוסקופ הלייזר וסגור את הצינור. אספו את כל הנוזלים בתחתית הצינור על ידי סיבוב קצר והניחו את הדגימה על קרח.
   7. המשך עם WGA תא יחיד או אחסן את הדגימות המבודדות ב -80 ° C למשך עד חודש אחד לפני עיבוד נוסף.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
McCoy's 5A Medium (1x) suppl. עם L-גלוטמין	תרמו פישר סיינטיפיק	16600-082	מדיום תרבית המשמש לתאי HT-29, מתאים את מדיום התרבית לקו התאים המשמש לניסויים
תמיסת חיץ HEPES (1 מטר)	הרשות הפלסטינית	S11-001	תוסף עבור McCoy's 5A Medium
סרום בקר עוברי זהב	הרשות הפלסטינית	א15-151	תוספת למדיום 5a שונה של McCoy
פניצילין-סטרפטומיצין (100x)	ביוווסט	L0018-100	תוספת למדיום 5a שונה של McCoy
מלח חוצץ פוספט (1x PBS)	תרמו פישר סיינטיפיק	10010-015
אקוטאזה	ביוווסט	L0950-100	תמיסת ניתוק תאים (תרבית תאים)
אמבט מים	GFL	סוג 1003	משמש לתמיסות טרום התחממות
אינקובטור	תרמו פישר סיינטיפיק		משמש לדגירת תאים (תרבית תאים)
צינורות תגובה של 50 מ"ל	VWR	525-0403
מיקסר רולר	סטיוארט סיינטיפיק	SRT6D	משמש לחיבור תאים לחוט תוך שמירה על התאים מפני משקעים
ערכת הפצת תאי CFSE של CellTrace	תרמו פישר סיינטיפיק	C34554	משמש לתיוג תאים חיים (תווית ציטופלזמית)
הוכסט 33342	H3570	תרמו פישר סיינטיפיק	משמש להכתמת DNA (כתם נגדי גרעין)
צנטריפוגה (מצוידת להחזקת צינורות תגובה של 15 מ"ל ו -50 מ"ל	תרמו פישר סיינטיפיק	Heraeus Megafuge 40R	משמש לתאי כדוריות
Observer Z1 (מיקרוסקופ פלואורסצנטי/לייזר)	קרל זיס מיקרודימות		מיקרוסקופ הפוך (immunofluorescence) המסוגל מיקרודיסקציה לייזר; מיקרוסקופים פלואורסצנטיים חייבים להיות מסוגלים לזהות Hoechst 33342 (מסנן DAPI) ו-CFSE (מסנן FITC)
אלבומין בסרום בקר (BSA)	סיגמא-אולדריץ'	A4503-50G	משמש לציפוי משטחי זכוכית/פלסטיק
MS1 Minishaker	סיגמא-אולדריץ'	Z404039	משמש למערבולות
Detektor CANCER03 DC03	גילופי	גיל003	חוט פונקציונלי המסוגל לבודד ולנתק תאי EpCAMpositive (המכונה גם לתפוס ולשחרר, C&R)
מחטי מזרק (G20)	VWR	613-0554	משמש לניקוב מכסי גומי על מנת לאפשר לחלק הלא פונקציונלי של ה- C&R להוביל דרכו
תא נויבאואר	רוט	T729.1	משמש לספירת תאים
פיפטות פסטר 150 מ"מ	וולאק	D810	משמש ליישום בנפח נמוך של תאים ל- C&R
עט גריז	דקו	S2002	משמש במגלשות זכוכית להחזקת מתלה התא במקומו
Delfia PlateShaker	פרקין אלמר	1296-003	משמש לתסיסה במהלך ניתוק תאים
צינורות 1.5 מ"ל	אפנדורף	30,125,150
ערכת Ampli1 WGA	סיליקון ביוסיסטמס		ניתן להזמין דרך סיליקון ביוסיסטמס
0.2 מ"ל צינורות PCR	ביואנזים	710920
ציטוצנטריפוגה וציוד	הטיך	יוניברסל 32	השתמש cytocentrifuge בהישג יד
Thermo cycler	ביו-ראד	דיאדה של מנוע DNA	ניתן להשתמש בכל thermo cycler עם מכסה מחומם
מיקרוצנטריפוגה	רוט	CX73.1	השתמש בצנטריפוגה שולחנית בהישג יד
UV Stratalinker 1800	סטרטג'ן	400072	השתמש ב- DNA cross linker בהישג יד

)