הזרקה תוך-ערמונית של תאים סרטניים: טכניקה להעברת תאים סרטניים לביסוס מודל עכבר אורתוטופי לסרטן הערמונית

תקציר

מקור: Anker, J. F. et al. Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Cirsted-resistant Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה אנו מדגימים את ההליך למתן הזרקה תוך ערמונית של תאי סרטן הערמונית למודל עכבר. מודלים אורתוטופיים של מורין יכולים לשמש לחקר מקור המחלה והתגובה לטיפולים בסביבה לא פולשנית ורלוונטית קלינית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת עכבר לפני הניתוח

הערה: יש לאחסן עכברים במתקן בעלי החיים באוניברסיטה לפחות שבוע לפני הניתוח כדי לאפשר הסתגלות נאותה ולמזער את הלחץ על בעלי החיים. שלבים 1.1-1.6 מבוצעים על ידי עוזר המנתח. כל השלבים הכירורגיים הבאים מבוצעים על ידי המנתח באמצעות כפפות סטריליות וכלי ניתוח בטכניקה סטרילית.

1. מרדימים את העכברים עם איזופלורן (2-5% לאינדוקציה דרך החדר, 1-3% לתחזוקה דרך חרוט האף). ודא אינדוקציה מלאה על ידי אובדן רפלקס צביטת הבוהן.
2. לשקול את העכברים ולנהל לפחות 0.05 מ"ג / ק"ג של משכך כאבים buprenorphine s.c.
   הערה: משקל עכבר ≥20 גרם אידיאלי להזרקות מוצלחות תוך ערמונית.
3. יש למרוח סיכה של משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית.
4. לגלח את כל הפרווה מהבטן.
5. לעקר את הבטן על ידי שלושה סבבים של יישום מעגלי של פילינג כירורגי באמצעות רפידות סטריליות שאינן נצמדות ואחריו מגבוני אלכוהול סטריליים. אפשר לבטן להתייבש.
   הערה: בשאר ההליך הכירורגי, יש להשתמש רק בכפפות סטריליות ובמכשירי ניתוח כדי ליצור קשר עם בטן העכבר המעוקרת.
6. העבירו את העכבר לשכיבה על משטח נקי על כרית חימום ישירות תחת המטרה של מיקרוסקופ כירורגי נקי.
7. מכסים את העכבר עם וילון סטרילי עם חור קטן לחתוך מעל הבטן.

2. הזרקה תוך ערמונית

הערה: בצע את כל שלבי הניתוח בתנאים סטריליים. התאמת המיקרוסקופ, מיקום העכבר או כל חפץ לא סטרילי אחר חייבת להיעשות בסיוע נוסף.

1. בצעו חתך של כ-1 ס"מ בעור החיצוני לאורך קו האמצע של הבטן מעל הפין והבלוטות (איור 1D).
2. מפרידים את רקמת החיבור בין עור הבטן החיצוני לשרירי הבטן הפנימיים על ידי פתיחת המספריים בין השכבות.
3. בצעו חתך דומה בשרירי הבטן הפנימית, והשתמשו במלקחיים כדי להרים את השרירים כדי למנוע ניקוב במעיים או בשלפוחית השתן (איור 1D).
4. אתרו את אחת משלפוחיות הזרע הדו-צדדיות (איור 1A, לבן)/אונות הערמונית הקדמיות (איור 1A, שחור), שהן לעתים קרובות אחוריות, צדדיות ומעט עליונות על שלפוחית השתן (איור 1A, צהוב), אולם זה עשוי להשתנות בין עכברים. אונות הערמונית הקדמיות שקופות ומחוברות לעקמומיות הפחותה של שלפוחיות הזרע הלבנות.
5. הרימו בעדינות את קצה שלפוחית הזרע באמצעות מלקחיים של רקמת Graefe כדי ליצור מתח על הרקמה מבלי לנקב את שלפוחית הזרע (איור 1E).
6. ערבבו את תמיסת המטריגל Myc-CaP על ידי פיפטינג עדין (המבוצע על ידי עוזר המנתח), כפי שהתאים עשויים להיות כדוריים, ולשאוף לאט 30 μL (1x10⁶ תאים) לתוך המחט כדי למנוע בועות אוויר.
7. בזהירות להכניס את השיפוע של המחט במקביל לציר הארוך של האונה הערמונית הקדמית. הזריקו באיטיות 30 μL לתוך האונה ואז משכו לאט את המחט כדי למנוע דליפה (איור 1F). ודאו הזרקה מתאימה על-ידי גודש של אונת הערמונית הקדמית (איור 1G).
8. בזהירות להחזיק את שלפוחית הזרע ואת אונת הערמונית מחוץ לעכבר במשך כ 30 s כדי לאפשר matrigel להתמצק חלקית בתוך האונה. במהלך תקופה זו, יש לאסוף כל דליפה של תמיסת תאים בבטן באמצעות אפליקטור סטרילי עם קצוות פוליאסטר כדי למנוע התפתחות גידול לא אורתוטופי מבלי ללחוץ על אונת הערמונית המוזרקת.
9. בזהירות להחזיר את שלפוחית הזרע ואת אונת הערמונית מוזרק לתוך הבטן מבלי להפעיל לחץ על האונה. החלף רקמות חיצוניות.
10. בצע תפרים רציפים לסגירת שרירי הבטן הפנימיים עם 5-0 תפרי מחט חיתוך לאחור נספגים 5-0.
11. בצע תפרים קטועים כדי לסגור את העור החיצוני של הבטן עם 4-0 תפרי מחט מונופילמנט ניילון שאינם נספגים בחיתוך הפוך. הערה: ניתן להשתמש בסיכות 9 מ"מ מעוקרות גם לסגירת העור החיצוני של הבטן. עם זאת, בניגוד לתפרים, הם מפריעים לכל אות הדמיה ביולומינסנטי ופלואורסצנטי עוקב
.
12. נקו את כל הכלים במגבוני אתנול סטריליים (שנפתחו על ידי עוזר המנתח) והניחו אותם במעקר חרוזי זכוכית למשך 30 שניות. הניחו לכלים להתייבש לפני השימוש בעכבר הבא.
13. יש לשטוף את המזרק והמחט במי מלח סטריליים (שנפתחים על ידי עוזר המנתח) למניעת סתימה על ידי שאריות מטריג'ל.
    הערה: עוזר מנתח צריך להיות נוכח בכל הניתוחים, ביצוע כל הכנת עכבר לא סטרילית לפני הניתוח וטיפול בעכבר לאחר הניתוח, כמו גם ערבוב תמיסת Myc-CaP matrigel לפני הזרקות. כדי למזער את הזמן, מכיוון שכל הליך עכבר תוך ערמונית ידרוש 20-30 דקות, עוזר המנתח יכול להתחיל להכין את העכבר הבא בזמן שהמנתח תופר את העכבר הנוכחי.

3. טיפול בעכבר לאחר הניתוח

1. יש לתת 1 מ"ג / ק"ג של משכך כאבים meloxicam s.c. מיד, 24 שעות, ו 48 שעות לאחר הניתוח.
2. אפשרו לעכברים להתאושש בכלוב ללא מצעים המונחים באמצע הדרך על כרית חימום. יש לעקוב אחר עכברים במשך 30 דקות לפחות לאחר הניתוח עד שיחזרו לניידות ולפעילות רגילה, ולאחר מכן הניחו אותם בכלוב נקי עם מזון על רצפת הכלוב.
3. מעקב נוסף אחר עכברים מדי יום לריפוי פצעים תקין, משקל גוף, טיפוח ואמבולציה לאחר הניתוח. הפרידו עכברים לכלובים נפרדים על כל עדות ללחימה.
4. יש להסיר את התפרים הנותרים תוך 14 יום לאחר הניתוח.

תוצאות

איור 1: אונה קדמית של הערמונית, ניקוז בלוטות הלימפה, וטכניקה מייצגת להזרקות תאים תוך ערמונית. תמונות של (A) אונת הערמונית הקדמית הימנית (שחורה, *), שלפוחית הזרע הימנית המחוברת (לבן), אשך ימין וכרית שומן (ירוק), ושלפוחית השתן (צהוב), (B) בלוטות לימפה פארא-אבי העורקים הדו-צדדיות המנקזות את הערמונית (כתום), (C) מספריים לניתוח מיקרו, מלקחיים Graefe, מלקח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו תאי Myc-CaP	ATCC	CRL-3255	יש לוודא שאין מיקופלזמה לפני השימוש
מספריים לניתוח זעיר	רובוז	RS-5910
מלקחיים Graege	רובוז	RS-5135
מלקחיים רקמת Graefe	רובוז	RS-5150
מחזיק מחט אולסן-הגר עם חותכי תפרים	FST	12002-12
מזרק 50 μL 705 RN SYR	המילטון	7637-01	עיקור על ידי גז אתילן אוקסיד
מחטים 28 מד רכזת קטנה RN H	המילטון	7803-02	סגנון נקודה 4, זווית 45°, אורך 0.75 אינץ'. מעוקר על ידי גז אתילן אוקסיד
סל"ד	גיבקו	18875-093
פ.ב.ס.	גיבקו	10437-028
עפרון/סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122
PBS	גיבקו	14190-144
Matrigel מרתף קרום מטריצה, ללא פנול אדום, ללא LDEV	קורנינג	356237	הפשרה על קרח ב-4°C למשך הלילה<רב/> לפני השימוש
איזופלורן	הנרי שיין	11695-0500-2	נרכש מהמרכז לרפואה השוואתית באוניברסיטת נורת'ווסטרן (CCM)
Buprenorphine hyrochloride 0.3 מ"ג/מ"ל		12496-0757-5	חומר מבוקר, נרכש מאוניברסיטת נורת'ווסטרן CCM
26 מזרק 5/8	ב.ד.	309597	עבור זריקות meloxicam ו buprenorphine
שימון משחת עיניים	אקרון	17478-162-35
פילינג כירורגי בטאדין (פובידוניודין, 7.5%)	מוצרי Purdue	67618-151-16
תחבושות סטריליות שאינן נצמדות	מור מדיקל	10775
מגבוני אלכוהול סטריליים	פישר סיינטיפיק	22-363-750
מיקרוסקופ כירורגי Stemi DV4	זיס
אפליקטורים סטריליים מפוליאסטר	פוריטני	25-806 1PD
5-0 Vicryl סופג חיתוך הפוך מחט תפרים	תפרים אלקטרוניים	J493G
4-0 ניילון monfilament לא נספג חיתוך אחורי תפרים מחט	תפרים אלקטרוניים	699H
מעקר חרוזי זכוכית	כלים מדעיים משובחים	18000-45
מי מלח סטריליים 0.9% נתרן כלורי	הוספירה	0409-4888-02