1. הכנת תאים להדמיה חיה
- לגדל תאי CWR22Rv1 המבטאים שרשרת אור 3 (LC3-GFP) מצומדת לחלבון פלואורסצנטי ירוק בתרבית RPMI המכילה 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה על צלחות תרבית זכוכית מצופות פולי-D-ליזין בקוטר 35 מ"מ. תאים צריכים להיות מצופים בצפיפות מספקת כדי להקל על התפשטות מהירה, אבל לא עד כדי כך שהתאים גדלים יתר על המידה וגושים בזמן ההדמיה.
- טפל בדגימות תאים נבחרות עם ADI (0.3 מיקרוגרם/מ"ל) ב-PBS.
- כשעה לפני ההדמיה, יש לדלל 1.5 μl של LysoTracker Red DND-99 (Invitrogen, CA) עם 20 מ"ל RPMI המכיל 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה. השתמש בפתרונות המכילים ADI עבור דוגמאות נבחרות. חממו את כל המדיה ל-37°C לפני הוספתה לצלחת התרבית.
- תאי דגירה עם RPMI המכיל LysoTracker Red DND-99 למשך 15-45 דקות ב-37°C.
- כ-30 דקות לפני ההדמיה, הפעל את המארז הסביבתי של WeatherStation ואפשר שיווי משקל ל-37°C ו-5% CO2 (עם אוויר לח).
- יש לשטוף תאים עם PBS ולהחליף מדיה בסל"ד סטנדרטי המכיל רק 10% FBS ו-1% אנטיביוטיקה. הוסף ADI לדוגמאות כפי שצוין.
- הרכיבו צלחות תרבית בתחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ בהתאמה אישית (Applied Precision, Inc., WA), ומקמו על במת המיקרוסקופ. השתמש בשמן טבילה (אינדקס שבירה 1.520) על עדשת האובייקט 60X 1.42 NA ומקם את צלחת התרבית המותקנת על הבמה.
2. סופר-רזולוציה, מיקרוסקופיית תאורה מובנית (OMX)
הערה: הפרוטוקול בסעיף זה חל על השימוש במיקרוסקופ הארה מובנית OMX (דיוק שימושי, WA).
- הפעל את החשמל הראשי ואת הלייזרים הרצויים (410 ננומטר, 488 ננומטר ו/או 532 ננומטר). המתן 20 דקות לייצוב תרמי של הלייזרים.
- הוסף שמן טבילה (אינדקס שבירה 1.516 עבור דגימות קבועות ב- RT) על עדשת האובייקט 60X 1.42 NA. אם רואים בועות בטיפת השמן, נקו את המטרה והוסיפו שמן שוב.
- הניחו את השקופית לדוגמה על הבמה ובמידת הצורך, המתינו 10 דקות עד שהתאים יתיישבו על הכיסוי.
- אתחל את תוכנית הרכישה. השתמש בתאורת פלואורסצנטיות כדי לכוונן את המיקוד עד שניתן יהיה לראות מתאר חד של התא.
הערה: יש להקפיד בכל עת למזער את חשיפת התאים לעירור פלואורסצנטי, עד לרכישת התמונה בפועל.
- ניתן לרכוש סריקת פסיפס ספירלי כדי להציג תצוגה מקדימה של אזורים גדולים יותר של הדגימה כדי לבחור תאים או אזורים מעניינים. מומלץ להשתמש בזמני חשיפה קצרים (1-10 מילישניות) ובעוצמת עירור נמוכה (0.1-1% שידור) בעת סריקת הדגימה או מציאת מטרות.
- זיהוי אוטופגוזומים על ידי פלואורסצנטיות GFP-LC3. זהה ליזוזומים באמצעות Alexa Fluor 555 anti-LAMP (חלבון קרום הקשור לליזוזומים) וגרעיני תאים באמצעות DAPI (דגימות קבועות).
- בחר תנאי ניסוי הכוללים אורך גל עירור, שטח תמונה (לדוגמה, 512x512), עובי מחסנית, זמן חשיפה ואחוז שידור לייזר. לתמונות עם פתרון סופר, ודאו שאפשרות התאורה המובנית מופעלת. עבור מיקרוסקופ deconvolution על OMX, בחר באפשרות תאורה קונבנציונאלי.
- לקבלת תוצאות השחזור הטובות ביותר, בחר תנאי ניסוי כך שספירת העוצמה המרבית תהיה בין 10,000 ל -15,000 במהלך הרכישה. אם יש חשש להלבנה פוטו, ניתן להשתמש בהדמיה בחשיפה נמוכה יותר (ספירה בין 5,000 ל-10,000). באופן אידיאלי, הספירה לא צריכה לרדת יותר מפקטור של שניים במהלך כל הרכישה, ויש להימנע מירידות ביותר מפקטור של ארבעה. במידת הצורך, הקטן את עובי הערימה כדי להבטיח ספירת עצימות מתמשכת. המצלמה רוויה ב-64,000 ספירות, כך שהעוצמה המרבית לעולם לא תעלה על זה. עבור דגימות טובות, מצאנו שתנאי הניסוי הם זמן חשיפה של 10~50 msec עם שידור לייזר של 1%. עדיפות לדוגמאות בהירות וניתנות לצילום שניתן לצלם שוב ושוב. כתם יציב נדרש לתמונות בהילוך מהיר וסופר-פתורות.
- כדי להפחית את הרעש, מומלץ מהירות קריאה של 95MHz (אפשרות מהירות בינונית) וזמן רכישה של 2msec או יותר. ממצאים מוגדלים מתקבלים בתמונה המשוחזרת כאשר הדגימה נעה במהלך הרכישה. בשל השפעה זו, חשיפות קצרות מומלצות לתאים שאינם דבקים או נעים במהירות.
- הדמיה רב ערוצית יכולה להתבצע בו זמנית או ברצף. מצב רציף מניב פחות crosstalk ולכן מומלץ.
- כדי להפחית את ההלבנה, מומלץ בדרך כלל לצלם תחילה באורכי גל עירור ארוכים יותר (532 ננומטר, 488 ננומטר ולאחר מכן 410 ננומטר). אולם עבור תוצאות הניסוי שהוצגו באיור 1, הסדר הזה התהפך (כלומר, 48 ננומטר, 532 ננומטר ו-410 ננומטר) עקב יציבות האור של הדגימה הספציפית הזו.
- הגדר את הגבול העליון/התחתון של ערימת Z על ידי הזזת שלב המיקרוסקופ עד שהחלק העליון/התחתון של התאים יוצא מעט מהפוקוס. המרחק הרצוי בין כל תמונה צריך להיות קבוע על 0.125 מיקרומטר עבור הדמיה ברזולוציית על, מכיוון שתוכנת שחזור לוקחת ערך זה כברירת מחדל.
- בנה מחדש ערימות תמונות באמצעות SoftWorX (Applied Precision, WA) ונתח באמצעות VoloCITY 6.0 (Perkin Elmer, MA).
