מיצוי חלבונים ופרוטאוליזה: שיטה לקבלת חלבונים מדגימות רקמת גידול הערמונית והעיכול האנזימטי שלהם לפפטידים

תקציר

מקור: Cheng, L. C. et al. העשרת פוספופפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה כמותית ללא תוויות לחקר הפוספופרוטאום בסרטן הערמונית. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מתאר את הטכניקה של מיצוי ועיכול חלבונים לקבלת פפטידים מרקמת הגידול בערמונית. פפטידים אלה בניתוח נוסף יכולים לסייע בזיהוי מטרות חדשות לאונקותרפיה.

פרוטוקול

1. מיצוי חלבונים

1. הכינו חיץ ליזיס (טבלה 1). (הנפח תלוי במספר הדגימות שיש לקצור).
2. קצירת רקמות
   1. לשקול את הגידול ולהוסיף 2 מ"ל של חיץ ליזה קר כקרח עבור כל 100 מ"ג של רקמה במבחנה תרבית. (בדרך כלל, יש צורך במשקל רטוב של 50 עד 150 מ"ג רקמות.)
3. הומוגניזציה של הליזט באמצעות הומוגנייזר ידני או benchtop (דופק 2x במשך 15 שניות). נקו את ההומוגנייזר לפני הדגימה הראשונה ובין הדגימות על ידי שימוש ב-10% אקונומיקה, 70% אתנול ומים שעברו דה-יוניזציה ברצף.
4. כדי להפחית אלקילט, לחמם את הדגימות הומוגניות ב 95 ° C במשך 5 דקות. לאחר מכן, מצננים אותם על קרח במשך 15 דקות. על קרח, sonicate lysate 3x (כלומר, פולס במשך 30 שניות עם 60 s הפסקות בין פולסים). הדגימה לא צריכה להיות צמיגה או גושית בשלב זה. מחממים את הליזט ב-95°C למשך 5 דקות.
5. צנטריפוגו את הליזט באותו צינור סוניקציה באמצעות רוטור דלי נדנדה בטמפרטורה של 3,500 x גרם ב-15°C למשך 15 דקות. אספו את הסופרנאטנט והשליכו את הכדור.
6. קבע את ריכוז החלבון על ידי ביצוע בדיקת ברדפורד. במידת הצורך, לדלל את הליזט ל 5 מ"ג / מ"ל עם חיץ ליזיס. אחסן אותו בטמפרטורה של -20°C.
   הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן. הקפיאו את הדגימות בטמפרטורה של -80°C והשתמשו בהן לניתוח נוסף.

2. עיכול ליזט

1. דללו את הדגימה פי 12 באמצעות 100 mM Tris (pH = 8.5) כדי להפחית את כמות הגואנידיניום. לדלל את כל הדגימות לאותו נפח כדי למזער את ההשפעות של עיכול לא שוויוני. שמור 12.5 מיקרוגרם של lysate מעוכל כדי לאשר את זה על ג'ל מוכתם Coomassie.
2. לקבלת 5 מ"ג חלבון, הוסיפו 10 מיקרוגרם של Lysyl Endopeptidase (Lys-C) ודגרו עליו בטמפרטורת החדר למשך 5-6 שעות. התאימו את ה-pH ל-8.0 על ידי הוספת 1 M Tris ללא טיטרציה (pH ~11).
3. הכינו 1 מ"ג/מ"ל של טריפסין L-1-tosylamido-2-phenylethyl chloromethyl ketone (TPCK) שטופל ב-1 mM HCl (עם 20 mM CaCl₂). הוסיפו את הטריפסין ביחס של 1:100 טריפסין:חלבון ודגרו עליו בטמפרטורה של 37°C למשך 3 שעות.
4. הוסף את אותה כמות של טריפסין טרי כמו בשלב 2.3. לדגור אותו ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.
5. שמור 12.5 מיקרוגרם של lysate מעוכל כדי לאשר את העיכול המלא על ג'ל מוכתם Coomassie.

3. חילוץ שלב הפוך

1. הקלט את עוצמת הקול של הליזט. סנן את הדגימה באמצעות מסנן חיתוך של 15 מ"ל 10 kDa . צנטריפוגה הדגימה ב 3,500 x גרם באמצעות רוטור דלי נדנדה (או 3,500 x גרם ברוטור זווית קבועה) ב 15 ° C עד נפח reentate הוא פחות מ 250 μL (זה לוקח בערך 45-60 דקות). אסוף את הזרימה והשלך את ה- retentate.

טבלה 1: מאגרים ופתרונות.טבלה זו מציגה את ההרכבים של המאגרים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

מאגר	נפח	הרכב
6 M גואנידיניום כלוריד ליזיס חיץ	50 מ"ל	6 M guanidinium כלוריד, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) פוספין, 40 mM chloroacetamide, 2 mM נתרן orthovanadate, 2.5 mM pyrophosphate נתרן, 1 mM β-glycerophosphate, 500 מ"ג n-octyl-glycoside, מים טהורים במיוחד לנפח
100 מ"מ נתרן פירופוספט	50 מ"ל	2.23 גרם נתרן פירופוספט דקהידראט, מים טהורים במיוחד לנפח
1M β-גליצרופוספט	50 מ"ל	15.31 גרם β-גליצרופוספט, מים טהורים במיוחד בנפח
5% חומצה טריפלואורואצטית	20 מ"ל	הוסף 1 מ"ל של 100% חומצה trifluoroacetic לתוך 19 מ"ל מים טהורים במיוחד
0.1% חומצה טריפלואורואצטית	250 מ"ל	הוסף 5 מ"ל 5% חומצה טריפלואורואצטית ל-245 מ"ל מים טהורים במיוחד
pY חיץ elution	250 מ"ל	0.1% חומצה טריפלואורואצטית, 40% אצטוניטריל, מים טהורים במיוחד לנפח
מאגר אלוציה pST	250 מ"ל	0.1% חומצה טריפלואורואצטית, 50% אצטוניטריל, מים טהורים במיוחד לנפח
מאגר איגוד IP	200 מ"ל	50 mM tris pH 7.4, 50 mM נתרן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
25 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 7.5	10 מ"ל	יש להמיס 19.7 מ"ג ב-10 מ"ל מים סטריליים טהורים במיוחד, pH עד 7.5 עם 1 N חומצה הידרוכלורית (~10-15 מיקרוליטר/10 מ"ל תמיסה), להכין טרי
חיץ פוספט 1M, pH 7	1,000 מ"ל	423 מ"ל 1 M נתרן דימימן פוספט, 577 מ"ל 1 M נתרן מימן פוספט
מאגר שיווי משקל	14 מ"ל	6.3 מ"ל אצטוניטריל, 280 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 1740 מיקרוליטר חומצה לקטית, 5.68 מ"ל מים טהורים במיוחד
חיץ שטיפה	20 מ"ל	9 מ"ל אצטוניטריל, 400 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 10.6 מ"ל מים טהורים במיוחד
פתרון ספקטרומטריית מסות	10 מ"ל	500 מיקרוליטר אצטוניטריל, 200 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 9.3 מ"ל מים טהורים במיוחד
חיץ א'	250 מ"ל	5 מ"מ מונופוטסיום פוספט (pH 2.65), 30% אצטוניטריל, 5 מ"מ אשלגן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
חיץ B	250 מ"ל	5 מ"מ מונופוטסיום פוספט (pH 2.65), 30% אצטוניטריל, 350 מ"מ אשלגן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
0.9% אמוניום הידרוקסיד	10 מ"ל	300 מיקרוליטר 29.42% אמוניום הידרוקסיד, 9.7 מ"ל מים טהורים במיוחד

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד	פנסוניק	MDF-U76V
מקפיא -20°C	VWR	SCPMF-2020
דלי רוטור נדנדה	תרמופישר סיינטיפיק	75004377
מסובב מקצה לקצה	תרמופישר סיינטיפיק	415110Q
צינורות אפנדורף דלי חלבון	אפנדורף	22431081
טריפסין, מטופל ב-TPCK	וורת'ינגטון ביוכימיקלים	LS003740
ליסיל אנדופפטידאז	Wako טהור תעשיות כימיות, בע מ	125-05061
מים מיליקיו			מים שעברו דה-יוניזציה משמשים להכנת כל התמיסות והחוצצים
סוניק דיסמברטור	פישר סיינטיפיק	FB-120	סוניקטור
מערכת פוליטרון PT	Kinematica AG	PT 10-35 GT	הומוגנייזר