טיהור פפטידים: טכניקה מבוססת RP-HPLC למיצוי פפטידים מליזטים חלבונים מעוכלים

תקציר

מקור: Cheng, L. C. et al. העשרת פוספופפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה כמותית ללא תוויות לחקר הפוספופרוטאום בסרטן הערמונית. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מדגימים כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך כדי לטהר פפטידים מתערובת חלבון ליזט מעוכל. פפטידים מטוהרים אלה עוברים לאחר מכן ליופיליזציה ומאוחסנים ליישומים במורד הזרם. ניתוח של פפטידים יכול לעזור להבין את המכניקה המעורבת איתות תאי וסרטן.

פרוטוקול

1. חילוץ שלב הפוך

1. התחילו עם חלבון ליזט מעוכל מראש בבקבוקון זכוכית. סנן את הדגימה באמצעות מסנן חיתוך של 15 מ"ל 10 kDa . צנטריפוגה הדגימה ב 3,500 x גרם באמצעות רוטור דלי נדנדה (או 3,500 x גרם ברוטור זווית קבועה) ב 15 ° C עד נפח reentate הוא פחות מ 250 μL (זה לוקח בערך 45 - 60 דקות). אסוף את הזרימה ומחק את retentate.
   NOTE: ניתן להשהות את הניסוי כאן. יש להקפיא את הדגימות בטמפרטורה של -80°C לשימוש מאוחר יותר.
2. כדי להחמיץ, יש להוסיף כ-20 מיקרוליטר של 5% חומצה טריפלואורואצטית (TFA) למ"ל ליזט. מערבבים אותם היטב ומודדים את רמת החומציות של הדגימה באמצעות רצועות pH. התאם את ה- pH ל- 2.5 באמצעות 5% TFA.
3. חבר את הקצה הקצר יותר של עמוד C-18 לסעפת ואקום. הגדר את השואב בין 17 ל 34 kPa (או על פי הוראות היצרן). באמצעות פיפטות זכוכית, להרטיב את העמוד עם 3 מ"ל של 100% acetonitrile (ACN). אל תתנו לעמוד להתייבש.
4. באמצעות פיפטות זכוכית, לאזן את העמוד עם 6 מ"ל של 0.1% TFA מוחל כמו 2x 3 מ"ל. טען את הדגימה המוחמצת לתוך העמודה. אין להוסיף יותר מ-3 מ"ל בכל פעם. התאימו את השואב לכוון לכ-1 עד 2 טיפות בשנייה.
5. באמצעות פיפטות זכוכית, לשטוף את העמוד עם 9 מ"ל של 0.1% TFA מוחל כמו 3x 3 מ"ל. להצדיע את העמוד עם 2 מ"ל של 40% ACN, 0.1% TFA. אספו שני שברים של 2 מ"ל לתוך צינורות תרבית זכוכית. מחק את העמודה.
6. מכסים את צינורות הפליטות בפרפילם ומנקבים 3-5 חורים על הכיסוי באמצעות מחט 20G. מקפיאים את הפולט על קרח יבש למשך 30 דקות לפחות עד שהוא מתמצק לחלוטין.
7. ליופיליזציה של השברים בן לילה. למחרת, ודא שהדגימות יבשות לחלוטין לפני הפסקת הליופיליזר. אחסנו את הצינורות בצינור חרוטי של 50 מ"ל עם מגבונים עדינים בטמפרטורה של -80°C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מקפיא בטמפרטורה נמוכה במיוחד	פנסוניק	MDF-U76V
מקפיא -20°C	VWR	SCPMF-2020
דלי רוטור נדנדה	תרמופישר סיינטיפיק	75004377
סעפת ואקום	רסטק	26080
ליופיליזר	לבקונקו	7420020
CentriVap Benchtop ואקום רכז	לבקונקו	7810010
יחידות סינון צנטריפוגליות Amicon Ultra-15	מיליפור סיגמא	UFC901024
מסובב מקצה לקצה	תרמופישר סיינטיפיק	415110Q
צינורות תרבית זכוכית	פישר סיינטיפיק	14-961-26
פארפילם	פישר סיינטיפיק	13-374-12
מחט 20 גרם	ב.ד.	B305175
מגבונים	פישר סיינטיפיק	06-666א
צינור קריוטיוב מכסה בורג	תרמופישר סיינטיפיק	379189
Nunc 15 מ"ל צינורות חרוטיים	תרמופישר סיינטיפיק	12-565-268
צינורות אפנדורף דלי חלבון	אפנדורף	22431081
מזרק 3 מ"ל	ב.ד.	309657
חומצה טריפלואורצטית (TFA)	פישר סיינטיפיק	PI-28904
אצטוניטריל (ACN)	פישר סיינטיפיק	א21-1
מים מיליקיו			מים שעברו דה-יוניזציה משמשים להכנת כל התמיסות והחוצצים

;