העשרת פוספופפטידים: טכניקת משקעים חיסוניים מבוססת נוגדנים להפרדת פפטידים זרחניים ספציפיים מתערובות פפטידים מורכבים

תקציר

מקור: Cheng, L. C., et al. העשרת פוספופפטיד בשילוב עם ספקטרומטריית מסה כמותית ללא תווית לחקר הפוספופרוטאום בסרטן הערמונית. J. Vis. Exp. (2018).

בסרטון זה אנו מדגימים משקעים חיסוניים מבוססי נוגדנים של פוספופפטידים מתערובת פפטידים. הפוספפטידים המועשרים מרוכזים בוואקום ומאוחסנים לניתוח במורד הזרם.

פרוטוקול

1. משקעים חיסוניים והעשרת פפטידים pY

1. השהה מחדש את האבקה הליופילית של עיכול פפטיד מטוהר עם 0.5 מ"ל של מאגר קושר משקעים חיסוניים קרים כקרח (IP) בכל שבר. אחסן את השברים על ידי העברת נפח המתלה של 0.5 מ"ל מהשבר השני לשבר הראשון ושמור את קצה הפיפטה. מערבולות נמרצות (במקום צנרת למעלה ולמטה) כדי להבטיח שהדגימה מומסת לחלוטין לפני העברתה לצינור קריובל מכסה בורג 3.6 מ"ל.
2. שטפו את צינורות הליופיליזציה עם עוד 0.5 מ"ל של מאגר קשירת IP (טבלה 1) בכל צינור. העבר את התמיסה לצינור מכסה בורג 3.6 מ"ל באמצעות אותו קצה פיפטה כדי למזער את אובדן הדגימה. חזור על השטיפה פי 1 יותר, מה שהופך את נפח התרחיף הסופי 2 מ"ל (עבור 5 מ"ג חלבון). מדדו את רמת החומציות של הדגימה כדי לוודא שהיא בערך 7.4. אם הוא חומצי מדי, הוסף באופן איטרטיבי 10 μL של 1M Tris (ללא טיטרציה, pH ~ 11). אם זה בסיסי מדי, להוסיף באופן איטרטיבי 10 μL של HCl מדולל (1:25 או 1:100).
3. לשטוף מראש את חרוזי pY (עבור 5 מ"ג של ליזט התחלתי)
   1. 25 מיקרוגרם של נוגדן 4G10 ו 12.5 מיקרוגרם של נוגדן 27B10.4 נדרשים לכל דגימה. לאחר שימוש בפיפט p200 עם קצה חתוך כדי העברת הנוגדנים לצינורות מיקרוצנטריפוגות נפרדות, שטפו את הנוגדנים עם 450 μL של חיץ קישור IP קר כקרח 2x. צנטריפואת אותם ב 100 x גרם במשך 1 דקה ב 4 ° C ולשאוף החוצה supernatant.
   2. השהה מחדש את החרוזים לריכוז מלאי של 0.5 מ"ג/מ"ל באמצעות מאגר קשירת IP. (אין לערבל את החרוזים.) לאחר ציטוט של הבוצה הדרושה (50 μL של תרחיף נוגדנים 4G10 ו- 25 μL 27B10.4 תרחיף נוגדנים לדגימה) לתוך צינור יחיד, סובבו את צינורות הצנטריפוגות ב 200 x גרם למשך דקה אחת ב 4 °C. שטפו את הדפנות עם supernatant לפני החזרת החרוזים לאחסון במקרר.
4. הוסף חרוזי pY שטופים מראש לתמיסת הדגימה התלויה מחדש בצינורות ההקפאה של מכסה הבורג. יש לדגור עליהם בטמפרטורה של 4°C על מסובב מקצה לקצה למשך הלילה.
5. הניחו את פקקי הבורג בצינור צנטריפוגה בנפח 50 מ"ל מרופד במגבון עדין. סובבו את החרוזים במהירות של 100 x גרם למשך דקה אחת. שמור את supernatant, אשר ישמש להעשרת פפטידים pST.
6. השהה מחדש את החרוזים עם 300 μL של מאגר קשירת IP. העבר אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל וסחרר אותם ב 100 x גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C.
7. שטפו את צינור הדגירה 3x עם 200 μL של מאגר קשירת IP. מעבירים את התכולה לאותו צינור מיקרוצנטריפוגה בכל פעם. לאחר מכן, סובב אותם.
8. שטפו את החרוזים בצינור המיקרוצנטריפוגה 3x עם 500 μL של מאגר קשירת IP וסובבו אותם ב 100 x גרם למשך דקה אחת. לאחר מכן, שטפו את החרוזים 4x עם 450 μL של 25 mM NH₄HCO₃, pH 7.5, וסובבו אותם ב 100 x גרם למשך דקה אחת. השתמש בתמיסת NH₄HCO₃ טרייה של 25 mM מכל פעם מאבקה.
9. צנטריפוגו את החרוזים במהירות של 1,500 x גרם למשך דקה אחת. השתמשו בקצה העמסת ג'ל כדי להסיר את הסופרנאטנט לחלוטין על ידי טבילת קצה קצה הג'ל מעט מתחת לפני השטח של החרוזים.
10. הוסף פי 4 נפח חרוזים של 0.1% TFA לחרוזים (כלומר, הוסף 300 μL של 0.1% TFA עבור 75 מיקרוגרם של pY חרוזי slurry). מערבבים היטב ודגרים על התערובת בתרמומיקסר ב-1,000 סל"ד למשך 15 דקות ב-37°C.
11. העבר את המתלה למסנן סחיטה של 0.2 מיקרומטר. סובב במהירות את צינור ה-elution והעבר את הנפח השיורי לאותו מסנן ספין באמצעות פיפטה P10. סובב את מסנן הסחיטה במהירות של 850 x גרם למשך דקה אחת. מעבירים את האלוציה לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון. יש לרכז ואקום את הפולט ליובש למשך הלילה בטמפרטורה של 40°C ובחום של 300 min.
    הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן. יש להקפיא את הדגימות בטמפרטורה של -80°C ולהמשיך במועד מאוחר יותר.

טבלה 1: מאגרים ופתרונות.טבלה זו מציגה את ההרכבים של המאגרים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

מאגר	נפח	הרכב
6 M Guanidinium כלוריד ליזיס חיץ	50 מ"ל	6 M guanidinium כלוריד, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) פוספין, 40 mM chloroacetamide, 2 mM נתרן orthovanadate, 2.5 mM pyrophosphate נתרן, 1 mM β-glycerophosphate, 500 מ"ג n-octyl-glycoside, מים טהורים במיוחד לנפח
100 mM נתרן pyrophosphate	50 מ"ל	2.23 גרם נתרן פירופוספט דקהידראט, מים טהורים במיוחד לנפח
1M β-גליצרופוספט	50 מ"ל	15.31 גרם β-גליצרופוספט, מים טהורים במיוחד בנפח
5% חומצה טריפלואורואצטית	20 מ"ל	הוסף 1 מ"ל של 100% חומצה trifluoroacetic לתוך 19 מ"ל מים טהורים במיוחד
0.1% חומצה טריפלואורואצטית	250 מ"ל	הוסף 5 מ"ל 5% חומצה טריפלואורואצטית ל-245 מ"ל מים טהורים במיוחד
pY חיץ elution	250 מ"ל	0.1% חומצה טריפלואורואצטית, 40% אצטוניטריל, מים טהורים במיוחד לנפח
מאגר אלוציה pST	250 מ"ל	0.1% חומצה טריפלואורואצטית, 50% אצטוניטריל, מים טהורים במיוחד לנפח
מאגר איגוד IP	200 מ"ל	50 mM tris pH 7.4, 50 mM נתרן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
25 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 7.5	10 מ"ל	יש להמיס 19.7 מ"ג ב-10 מ"ל מים סטריליים טהורים במיוחד, pH עד 7.5 עם 1 N חומצה הידרוכלורית (~10-15 מיקרוליטר/10 מ"ל תמיסה), להכין טרי
חיץ פוספט 1M, pH 7	1,000 מ"ל	423 מ"ל 1 M נתרן דימימן פוספט, 577 מ"ל 1 M נתרן מימן פוספט
מאגר שיווי משקל	14 מ"ל	6.3 מ"ל אצטוניטריל, 280 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 1740 מיקרוליטר חומצה לקטית, 5.68 מ"ל מים טהורים במיוחד
חיץ שטיפה	20 מ"ל	9 מ"ל אצטוניטריל, 400 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 10.6 מ"ל מים טהורים במיוחד
פתרון ספקטרומטריית מסות	10 מ"ל	500 מיקרוליטר אצטוניטריל, 200 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 9.3 מ"ל מים טהורים במיוחד
חיץ א'	250 מ"ל	5 מ"מ מונופוטסיום פוספט (pH 2.65), 30% אצטוניטריל, 5 מ"מ אשלגן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
חיץ B	250 מ"ל	5 מ"מ מונופוטסיום פוספט (pH 2.65), 30% אצטוניטריל, 350 מ"מ אשלגן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
0.9% אמוניום הידרוקסיד	10 מ"ל	300 מיקרוליטר 29.42% אמוניום הידרוקסיד, 9.7 מ"ל מים טהורים במיוחד

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ליופיליזר	לבקונקו	7420020
CentriVap Benchtop ואקום רכז	לבקונקו	7810010
מגבונים	פישר סיינטיפיק	06-666א
מסנן סחיטה Millipore 0.2 מיקרומטר	מיליפור סיגמא	UFC30GVNB
צינורות אפנדורף דלי חלבון	אפנדורף	22431081
אנטי פוספוטירוזין, אגרוז, שיבוט: 4G10	מיליפור סיגמא	16101
נוגדן 27B10.4	שלד ציטו-שלד	APY03-חרוזים
ערכת בדיקת פפטיד	תרמו סיינטיפיק	23275
טיפ עליון	PolyLC Inc	TT200TIO.96
עמודות SCX (PolySULFOETHYL A)	PolyLC Inc	SPESE1203
מזרק 3 מ"ל	ב.ד.	309657
מים מיליקיו			מים שעברו דה-יוניזציה משמשים להכנת כל התמיסות והחוצצים
חומצה טריפלואורצטית (TFA)	פישר סיינטיפיק	PI-28904
אצטוניטריל (ACN)	פישר סיינטיפיק	א21-1
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP366-500
חומצה לקטית	סיגמא-אולדריץ'	69785-250 מ"ל
אמוניום הידרוקסיד	פישר סיינטיפיק	A669S-500
בסיס טריס	פישר סיינטיפיק	BP152-5