העשרה על בסיס טיטניום דו-חמצני של פוספופפטידים: שיטה לבידוד סלקטיבי של פוספפטידים מספריית הפפטידים:

Abstract

מקור: Cheng, L. C. et al. העשרת פוספופפטיד יחד עם ספקטרומטריית מסה כמותית ללא תוויות לחקר הפוספופרוטאום בסרטן הערמונית. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים העשרה מבוססת טיטניום דו-חמצני של פוספופפטידים המופקים מרקמת הגידול בערמונית. פוספו-פפטידים מועשרים אלה יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם, כגון אפיון חלבונים, כדי להבין מסלולי איתות תאיים המעורבים בהתקדמות סרטן הערמונית.

Protocol

1. טיטניום דו-חמצני העשרת פפטידים pY

1. להשהות מחדש את phosphopeptides מיובשים ב 200 μL של 50% ACN, 0.1% TFA. מערבלים וצנטריפוגות אותם במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות. חזור על זה 1x כדי להשעות אותם היטב.
2. הכנת חרוזי TiO₂ הכלולים בטיפים בעלי קיבולת של 200 μL דגימות.
   1. הקש בעדינות על קצה הצד הקטן של הקצה כדי להזיז את החומר למטרה זו. שטפו את הקצה על ידי הוספת 200 μL של 100% ACN, ולאחר מכן היפוך הקצה והזזת הקצה הקטן כדי להזיז את הנוזל לכיוון הפקק.
   2. בעזרת סכין גילוח, חתכו את הקצה הקטן של הקצה והניחו אותו על צינור דל בקשירת חלבון. (הימנע משימוש בצינורות פוליסטירן מכיוון שה- TiO₂ יידבק לצידי הצינור.) הסר את המכסה והכנס מיקרופיפטה כדי לצלול החוצה ACN שנותר. חזור על הכביסה עם 200 μL של 100% ACN. חרוזי TiO₂ ממוקמים כעת בצינור קושר חלבון נמוך עבור השלבים הבאים.
   3. תנאי מקדים TiO₂ עם 500 μL של 100% ACN 2x. לערבב את החרוזים עם הממס. צנטריפוגר אותם ב 100 x גרם במשך 1 דקה.
   4. תנאי TiO₂ עם 500 μL של 0.2 M נתרן פוספט חיץ (pH ~ 7) 2x. לשטוף את החרוזים עם 300 μL של חיץ שיווי משקל 3x. מכיוון ש- TiO₂ צפוף מאוד, החרוזים ישקעו במהירות.
3. הוסף 400 μL של 50% ACN, 0.1% TFA לתוך צינור קישור חלבון נמוך, ולאחר מכן להוסיף 84 μL של חומצה לקטית. העבירו את הפוספפטידים המרחפים לתוך הצינור בעל קשירת החלבונים הנמוכה ודגרו עליהם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב מקצה לקצה.
4. צנטריפוגות את החרוזים ב 100 x גרם במשך 1 דקה כדי pellet אותם. שטפו אותם עם 300 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל (טבלה 1) 2x וסובבו אותם כלפי מטה במהירות של 100 x גרם למשך דקה אחת.
5. שטפו את החרוזים עם 300 מיקרוליטר של מאגר שטיפה 2x. העבירו אותם למסנן סיבוב של 0.2 מיקרומטר. סובבו אותם במהירות של 1,500 x גרם למשך דקה אחת.
6. העבירו את יחידת המסנן לצינור נקי בנפח 1.5 מ"ל עם רמת חלבון נמוכה. הקלו את התוכן פי 2 עם 200 μL של 0.9% NH₃ ב-H₂O. מדדו את ה-pH עם רצועות pH, שאמורות להיות בין 10 ל-11. רכז ואקום את הפולט לייבוש לילה כדי לאדות את האמוניה.

טבלה 1: מאגרים ופתרונות.טבלה זו מציגה את ההרכבים של המאגרים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

מאגר	נפח	הרכב
6 M גואנידיניום כלוריד ליזיס חיץ	50 מ"ל	6 M guanidinium כלוריד, 100 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-carboxyethyl) פוספין, 40 mM chloroacetamide, 2 mM נתרן orthovanadate, 2.5 mM pyrophosphate נתרן, 1 mM β-glycerophosphate, 500 מ"ג n-octyl-glycoside, מים טהורים במיוחד לנפח
100 מ"מ נתרן פירופוספט	50 מ"ל	2.23 גרם נתרן פירופוספט דקהידראט, מים טהורים במיוחד לנפח
1M β-גליצרופוספט	50 מ"ל	15.31 גרם β-גליצרופוספט, מים טהורים במיוחד בנפח
5% חומצה טריפלואורואצטית	20 מ"ל	הוסף 1 מ"ל של 100% חומצה trifluoroacetic לתוך 19 מ"ל מים טהורים במיוחד
0.1% חומצה טריפלואורואצטית	250 מ"ל	הוסף 5 מ"ל 5% חומצה טריפלואורואצטית ל-245 מ"ל מים טהורים במיוחד
pY חיץ elution	250 מ"ל	0.1% חומצה טריפלואורואצטית, 40% אצטוניטריל, מים טהורים במיוחד לנפח
מאגר אלוציה pST	250 מ"ל	0.1% חומצה טריפלואורואצטית, 50% אצטוניטריל, מים טהורים במיוחד לנפח
מאגר איגוד IP	200 מ"ל	50 mM tris pH 7.4, 50 mM נתרן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
25 מ"מ אמוניום ביקרבונט, pH 7.5	10 מ"ל	יש להמיס 19.7 מ"ג ב-10 מ"ל מים סטריליים טהורים במיוחד, pH עד 7.5 עם 1 N חומצה הידרוכלורית (~10-15 מיקרוליטר/10 מ"ל תמיסה), להכין טרי
חיץ פוספט 1M, pH 7	1,000 מ"ל	423 מ"ל 1 M נתרן דימימן פוספט, 577 מ"ל 1 M נתרן מימן פוספט
מאגר שיווי משקל	14 מ"ל	6.3 מ"ל אצטוניטריל, 280 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 1740 מיקרוליטר חומצה לקטית, 5.68 מ"ל מים טהורים במיוחד
חיץ שטיפה	20 מ"ל	9 מ"ל אצטוניטריל, 400 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 10.6 מ"ל מים טהורים במיוחד
פתרון ספקטרומטריית מסות	10 מ"ל	500 מיקרוליטר אצטוניטריל, 200 מיקרוליטר 5% חומצה טריפלואורואצטית, 9.3 מ"ל מים טהורים במיוחד
חיץ א'	250 מ"ל	5 מ"מ מונופוטסיום פוספט (pH 2.65), 30% אצטוניטריל, 5 מ"מ אשלגן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
חיץ B	250 מ"ל	5 מ"מ מונופוטסיום פוספט (pH 2.65), 30% אצטוניטריל, 350 מ"מ אשלגן כלורי, מים טהורים במיוחד לנפח
0.9% אמוניום הידרוקסיד	10 מ"ל	300 מיקרוליטר 29.42% אמוניום הידרוקסיד, 9.7 מ"ל מים טהורים במיוחד

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
סעפת ואקום	רסטק	26080
ליופיליזר	לבקונקו	7420020
CentriVap Benchtop ואקום רכז	לבקונקו	7810010
מסובב מקצה לקצה	תרמופישר סיינטיפיק	415110Q
סכין גילוח	פישר סיינטיפיק	620177
יחידות סינון צנטריפוגליות Amicon Ultra-15	מיליפור סיגמא	UFC901024
Nunc 15 מ"ל צינורות חרוטיים	תרמופישר סיינטיפיק	12-565-268
מסנן סחיטה Millipore 0.2 מיקרומטר	מיליפור סיגמא	UFC30GVNB
צינורות אפנדורף דלי חלבון	אפנדורף	22431081
אנטי פוספוטירוזין, אגרוז, שיבוט: 4G10	מיליפור סיגמא	16101
ערכת בדיקת פפטיד	תרמו סיינטיפיק	23275
חומצה טריפלואורצטית (TFA)	פישר סיינטיפיק	PI-28904
אצטוניטריל (ACN)	פישר סיינטיפיק	א21-1
חומצה לקטית	סיגמא-אולדריץ'	69785-250 מ"ל
אמוניום הידרוקסיד	פישר סיינטיפיק	A669S-500
אשלגן פוספט מונובייסיק	פישר סיינטיפיק	BP362-500
אשלגן כלורי	פישר סיינטיפיק	BP366-500
סידן כלורי דיהידראט	פישר סיינטיפיק	BP510-500
בסיס טריס	פישר סיינטיפיק	BP152-5
מונוטיפ	PolyLC Inc	TT200TIO.96