העשרה על בסיס טיטניום דו-חמצני של פוספופפטידים: שיטה לבידוד סלקטיבי של פוספפטידים מספריית הפפטידים:

1. טיטניום דו-חמצני העשרת פפטידים pY

1. להשהות מחדש את phosphopeptides מיובשים ב 200 μL של 50% ACN, 0.1% TFA. מערבלים וצנטריפוגות אותם במהירות של 10,000 x גרם למשך 30 שניות. חזור על זה 1x כדי להשעות אותם היטב.
2. הכנת חרוזי TiO₂ הכלולים בטיפים בעלי קיבולת של 200 μL דגימות.
   1. הקש בעדינות על קצה הצד הקטן של הקצה כדי להזיז את החומר למטרה זו. שטפו את הקצה על ידי הוספת 200 μL של 100% ACN, ולאחר מכן היפוך הקצה והזזת הקצה הקטן כדי להזיז את הנוזל לכיוון הפקק.
   2. בעזרת סכין גילוח, חתכו את הקצה הקטן של הקצה והניחו אותו על צינור דל בקשירת חלבון. (הימנע משימוש בצינורות פוליסטירן מכיוון שה- TiO₂ יידבק לצידי הצינור.) הסר את המכסה והכנס מיקרופיפטה כדי לצלול החוצה ACN שנותר. חזור על הכביסה עם 200 μL של 100% ACN. חרוזי TiO₂ ממוקמים כעת בצינור קושר חלבון נמוך עבור השלבים הבאים.
   3. תנאי מקדים TiO₂ עם 500 μL של 100% ACN 2x. לערבב את החרוזים עם הממס. צנטריפוגר אותם ב 100 x גרם במשך 1 דקה.
   4. תנאי TiO₂ עם 500 μL של 0.2 M נתרן פוספט חיץ (pH ~ 7) 2x. לשטוף את החרוזים עם 300 μL של חיץ שיווי משקל 3x. מכיוון ש- TiO₂ צפוף מאוד, החרוזים ישקעו במהירות.
3. הוסף 400 μL של 50% ACN, 0.1% TFA לתוך צינור קישור חלבון נמוך, ולאחר מכן להוסיף 84 μL של חומצה לקטית. העבירו את הפוספפטידים המרחפים לתוך הצינור בעל קשירת החלבונים הנמוכה ודגרו עליהם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב מקצה לקצה.
4. צנטריפוגות את החרוזים ב 100 x גרם במשך 1 דקה כדי pellet אותם. שטפו אותם עם 300 מיקרוליטר של מאגר שיווי משקל (טבלה 1) 2x וסובבו אותם כלפי מטה במהירות של 100 x גרם למשך דקה אחת.
5. שטפו את החרוזים עם 300 מיקרוליטר של מאגר שטיפה 2x. העבירו אותם למסנן סיבוב של 0.2 מיקרומטר. סובבו אותם במהירות של 1,500 x גרם למשך דקה אחת.
6. העבירו את יחידת המסנן לצינור נקי בנפח 1.5 מ"ל עם רמת חלבון נמוכה. הקלו את התוכן פי 2 עם 200 μL של 0.9% NH₃ ב-H₂O. מדדו את ה-pH עם רצועות pH, שאמורות להיות בין 10 ל-11. רכז ואקום את הפולט לייבוש לילה כדי לאדות את האמוניה.

טבלה 1: מאגרים ופתרונות.טבלה זו מציגה את ההרכבים של המאגרים והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.